间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的igg

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1、间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG目的微小巴贝西IgG抗体试剂盒用来检测或半定量人微小巴贝西IgG抗体。试验总结和解释北美巴贝西虫病是由微小巴贝西虫引起的，通过被感染的蜱的叮咬传播，通常认为贝西虫病可以通过噬吞噬细胞无形体和（或）伯氏疏螺旋体共传播。传统方法通过外周血涂片制作薄血膜观察红细胞内部特征性的内含物。免疫荧光法用微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞作为特征性内含物的来源用来进行特异性抗体检测。病人血清稀释缓冲液在孔板中孵化使得抗体和微小巴贝西抗原反应。洗板移去未反应的血清蛋白，然后加入荧光标记的

2、抗人IgG，这个结合物需要时间与抗原抗体化合物反应。再一次洗板移去未反应的结合物。反应结果通过荧光显微镜，观察，阳性结果被视为苹果绿的荧光内含物包裹在被感染的红细胞里。空白对照是没有荧光或荧光类似物在对照孔，阳性对照通过高倍稀释确定最高活性或终点稀释。试剂加样板10*12孔涂有包括微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞，真空包装。IgG结合物，2.5ML黄色帽滴管含有亲和纯化的DyLight488荧光标记羊抗人牛血清白蛋白IgM和伊文思兰试剂。阳性对照，0.5ML蓝色帽滴管含有人反应性的血清1:64的稀释倍数，终点滴度是1

3、：512。阴性对照，0.5ML红色帽滴管含有人非反应性的血清1:50倍稀释。封片剂，1ML白色帽滴管含有50%甘油磷酸盐缓冲液。PBS，1L粉剂溶于1L纯净水中配制成PH7.2的磷酸盐缓冲液。警告1.对照血清经过食品药品管理局的传染性检测，然而由于没有测试能确保传染性不存在，这些试剂和血清标本应避免皮肤接触和摄入。2.反应板是经过化学灭活的抗原，具有潜在的传染性，应进行相应处理。保存试剂盒应存放在2-8℃，在室温中打开滴管和加样板袋。标本采集血液凝固后离心分离血清，血清移至密封的灭菌管，存放在2-8℃。如果实验操作超

4、过五天，样品存放在-20℃冷冻。急性期标本在疾病发作期采样，恢复期标本在间歇期收集检查滴度变化。步骤试剂盒提供的材料可以做120次测定。需要的材料蒸馏水或去离子水干净的250或500ML瓶子用于PBS血清稀释的试管或微孔板精密管24*50mm盖玻片荧光显微镜和400倍放大镜37℃水浴箱或孵化器孵育箱注意事项1.保质期之前使用。2.结合物是感光的被封装在不透明的塑料袋中，避光存放。3.结合物含有伊文思兰燃料，可能有致癌性。避免皮肤接触。4.液体试剂含有0.001%乙汞硫酸钠，如果摄入可能具有毒性。准备试剂PBS：1L纯

5、净水稀释，混合至全部溶解。操作步骤所有试剂和血清到达室温后开始实验。1.给所有病人血清按1:64配筛选稀释缓冲液。根据之前的实验结果，1:64稀释缓冲液血清开始出现阳性结果。2.配制阳性对照的稀释液，高于上述稀释终点一倍至低于稀释终点一倍（如1:256-1：1024）。注意此对照是装在1:64倍稀释的瓶中。3.每孔加入10ul血清稀释液，记录位置。每次实验包括阴性对照和上面准备的阳性对照。4.加样板放在孵育箱中37℃±0.5℃孵育30分钟。5.PBS轻洗板上的加样孔，摇晃或轻拍PBS水珠至水槽，重复洗三遍不让孔干燥。

6、6.每个加样孔加入1滴（10ul）结合物，加样板放在孵育箱中37℃±0.5℃再孵育30分钟。孵育中注意避光。7.按步骤5洗板。8.每孔加入2-3滴封片剂，盖上盖玻片。9.400*镜下观察反应板，每孔与阴性和阳性对照的视觉强度比较。板可在2-8℃避光保存24小时质量控制阴性对照血清和阳性血清稀释液每次试验都要做。阴性对照孔是非反应性的血清，既没有统一红复染也没有绿染。阳性对照孔终点滴度是1：256至1：1024。1：512的荧光强度通常作为反应终点。如果没有出现描述的对照，实验可能作废，试剂成分和程序步骤应复查，从步骤

7、1开始重做。阴性对照孔是没有荧光标记的，如果阴性孔中观察到与阳性孔类似的特征性内含物，实验要重做。结果说明阳性反应表现为在感染的红细胞周围聚集明显的苹果绿色内含物，大小和密度必须与阴性及阳性反应比较。