人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究.doc

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1、人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究【摘要】目的：在大肠杆菌中克隆和表达人源胸腺肽（thymosinβ4，TB4）基因并进行分离纯化及促血管生成生物活性鉴定。方法：人工设计TB4基因片段，其密码子为大肠杆菌所偏爱，将合成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段，与pET28a(+)载体连接成重组表达质粒pET28aTB4，将其转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达带His6Tag的融合蛋白His6TB4，通过镍柱亲和层析纯化，采用SDSP

2、AGE分析鉴定，由CAM试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定，重组质粒pET28aTB4构建成功，IPTG诱导后的融合蛋白His6TB4在大肠杆菌中得到高效表达，并经一步镍柱亲和层析即获得纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论：获得高效表达的、高纯度的His6TB4融合蛋白，为TB4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基础。【关键词】人胸腺肽β4表达镍柱纯化鸡胚尿囊膜实验胸腺肽β4（thymosinβ4,TB4）是从胸腺素组分5（F5）中

3、分离得到的，是生物体内丰度最高且高度保守的一种βthymosin。它不仅存在于胸腺中，还存在机体众多组织中，在参与调节免疫及细胞生理活动等一系列过程中呈现功能多样性，因此引起了研究者的广泛关注[12]。TB4是由43个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约5000，等电点5.1，以前多认为其定位于细胞浆中，目前有报道说它也有细胞核的定位[3]。最近报道表明，TB4可以促进毛细血管生成和创伤愈合，降低炎症反应，抑制一些上皮细胞的凋亡，在医学治疗疾病中大有潜力[46]。本研究设计并合成TB4的编

4、码基因，在大肠杆菌中实现它的高效表达，进行分离纯化，并进行其促毛细血管生成活性初步鉴定，旨在为今后对TB4蛋白功能的进一步研究和药物开发打下基础。1材料和方法1.1试剂、质粒及菌株pET28a(+)质粒、大肠杆菌Top10、BL21(DE3)由本实验室保存；PCR试剂、限制性内切酶、Klenow酶、T4连接酶等酶类购自大连TaKaRa公司；IPTG购自华美生物工程公司；3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；MicroBCAKit购自PIERCEChemic

5、al公司；NiIDA填料由本实验室提供。1.2方法1.2.1重组质粒的构建51.2.1.1TB4目的基因片段的获得TB4基因序列来源于NCBI数据库，并根据大肠杆菌密码子偏爱性，对其进行适当的修改。设计5个基因片段，由上海英骏（Invitrogen）公司合成。1.2.1.2TB4基因的拼接将合成的基因片段1（5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAG3′）和基因片段2（5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTT

6、TTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′）退火，利用Klenow酶延伸补平；相同的方法将基因片段3（5′AACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′）和基因片段4（5′GGCGAGCTCTAGGATTCACCAGCCTG3′）退火补平。两次退火得到2个DNA大片段（A和B），将DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。1.2.1.3PCR扩增TB4基因以退火得到的TB4基因为模板

7、，基因片段5（5′GGAATTCCATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGACAAACCGGAC3′）和基因片段4为引物，进行PCR扩增（图1）。PCR循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃复性40s，72℃延伸40s,循环28次；末次延伸为72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶纯化试剂盒纯化。图1TB4目的基因合成过程示意图1.2.1.4pET28aTB4重组质粒的构建与测序鉴定将纯化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI双酶切，用T

8、4连接酶连接于已同样酶切的pET28a(+)质粒中，再转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，挑单菌落进行PCR鉴定为阳性的克隆送上海英骏（Invitrogen）公司测序鉴定。1.2.2融合蛋白His6TB4在大肠杆菌中的诱导表达和纯化将重组质粒pET28aTB4转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑单克隆于1L含卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37℃摇菌培养，当其A600达到0.8时，加入终浓度为1mmol·L-1IPTG，诱导35h；离心收获菌体，进行SDSPAGE分析。将表达