细胞周期及细胞凋亡

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第十六章细胞凋亡（APOPTOSIS） 1．凋亡概念的形成：1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞，这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集，从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。一.细胞凋亡的研究历史 2．细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段：(1972-1987)①利用光镜和电镜对细胞形态学特征进行了详细的研究；②染色体DNA的降解，细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解；③RNA／蛋白质大分子的合成；④钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件；⑤内源性核酸内切酶，细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。 3.蛋白质水解酶活化的研究(1995)4.细胞膜的变化(1997)5.线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)1)相关基因及调控2）信号转导3）各种分子及其相互作用及相互关系4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。 二.概念细胞凋亡（Apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与坏死的区别坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。 特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减少、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式 凋亡小体(apoptoticbody)细胞凋亡过程中，凋亡细胞经核碎裂形成的染色质块(核碎片)，然后整个细胞通过发芽(bybudding)、起泡(byzelosls)等方式形成一个球形的突起，并在其根部绞窄而脱落形成一些大小不等，内含胞质、细胞器及核碎片的小体称为凋亡小体。 三.细胞凋亡的生物学特征（一）形态学变化（二）生物化学变化DNA片段化大分子的合成tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。 （一）细胞凋亡的形态特征（1）凋亡的起始：微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离；细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩。（2）细胞质密度增加。（3）凋亡小体的形成。（4）凋亡小体逐渐被吞噬细胞吞噬。 四.细胞凋亡的过程及机理接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的级联反应 五、细胞凋亡的两条通路1.膜受体的信号转导参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD—细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白FasL+Fas（死亡结构域）+FADD—细胞凋亡CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白 细胞凋亡的膜受体通路细胞凋亡调控因子FASL+FAS+FADD凋亡诱导复合物（DISC）胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8死亡受体活化，细胞凋亡 2.线粒体与细胞凋亡线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径释放caspase活化因子细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡体AIF（凋亡诱导因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子 五.凋亡的效应分子细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。 破坏细胞抗凋亡因素正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。 破坏细胞结构Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。 影响核酸的结构与功能Caspase可作用于多种与DNA，RNA功能有关的蛋白，如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。 六.细胞凋亡的调节1.Bcl-2家族Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命名为BHl、BH2、BH3和BH4。可分为3个亚族： 2.VDAC和ANT是线粒体外膜上最为丰富的两种蛋白。最近有一些研究表明，WDAC和ANT可与Bc1-2家族蛋白相互作用，在细胞凋亡过程中介导对线粒体的损伤。VDAC本身是一种通道蛋白，它与Bax的结合可使共通道性能发生某种变化，这样一些凋亡蛋白如cytC就可通过。 3.P53与细胞凋亡P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。 4.IAP（inhibitorofapoptosis，细胞凋亡抑制因子）IAP超家族的成员较多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个７０个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用。 5.Smac/Dablo在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。促进凋亡。 七.细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡与个体发育细胞凋亡与免疫细胞凋亡与人类疾病 免疫细胞凋亡胸腺细胞成熟过程中的凋亡阳性选择阴性选择激活诱导的细胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）CTL诱导靶细胞的凋亡Fas介导的靶细胞凋亡B细胞凋亡:经过基因重排,92%的细胞凋亡 细胞凋亡与人类疾病细胞凋亡受抑制有关的疾病恶性肿瘤:滤泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、肾炎病毒感染性疾病：腺病毒病、庖疹病毒病细胞凋亡增多有关的疾病艾滋病：神经变性性疾病：早老性迟呆、帕金森病、小脑退化病骨髓发育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎 八.细胞凋亡的检测方法（一）细胞凋亡的形态学检测（二）磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）（三）线粒体膜势能（mt）的检测（四）DNA片断化检测（五）TUNEL法（六）Caspase-3活性的检测（七）WB检测 （一）细胞凋亡的形态学检测1.光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 （一）细胞凋亡的形态学检测2.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI4（6-diamidino2-phenyl-indoledihydrochloride）。 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400） （一）细胞凋亡的形态学检测3.电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 （二）磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI （三）线粒体膜势能（mt）的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 （四）DNA片段化分析细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。