real-time pcr实验注意事项

real-time pcr实验注意事项

ID:1701097

大小:45.50 KB

页数:5页

时间:2017-11-13

real-time pcr实验注意事项_第1页
real-time pcr实验注意事项_第2页
real-time pcr实验注意事项_第3页
real-time pcr实验注意事项_第4页
real-time pcr实验注意事项_第5页
资源描述:

《real-time pcr实验注意事项》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、Real-timePCR实验注意事项实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱,切记切记多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1.  所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.  塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。3.  有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%

2、H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。4.  配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.  操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。6.  设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最

3、有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液

4、(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理(一)动植物总RNA提取-Trizol法  Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑

5、点杂交,Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。  1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。  2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。  3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。  4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g

6、离心5分钟。  5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。  [注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值  2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。总mRNA的提取(自己的经验)一、  关于TrizolReagent需要的

7、试剂1.  Chloroform:氯仿(分析纯)2.  Isoproplylalcohol:异丙醇(分析纯)3.  75%Ethanol(inDEPC-treatedwater):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4.  RNase-freewater:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml(50ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(150℃3小时)5.  一次性塑料手套6.  注意:DEPC有致癌之嫌二、  关于TrizolReagent的使

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。