pcr实验注意事项

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1、实验中的一些好习惯加入试剂之前，把它混匀一下，以免放筲时间长了浓度不均移液枪川完之后要归到最人计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这儿乎是最快提卨的捷径了所有的试剂都tl己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180°C的高温K干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿川'用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因吋被氯仿腐蚀，故不能使用)。3.有机玻璃的电泳梢等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2()2室温lOmin,然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

2、4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37°C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无茼双蒸水配制，然后经0.22uni滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性U罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专川实验室，所侖器械等应为专川。二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈识不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫瓿酸胍：口前被汄为是最介效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。仑既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白屮

3、解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核幵笈合物：由氧化钒离了和核幵形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RXA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盌屮提取得來的酸性糖蛋白。RXasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多利1KNA酶结合，使.M:失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RXA酶也旮一定抑制作川。因为DEPc不加选择的修饰蛋Ll质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使川，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所冇KXA实验屮，谅关键的W素是分离得到全长的RXA。而实验失败的主要原W是核糖核酸酶

4、(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被火活，如煮沸、髙压火菌等。研究人员造成的污染RXA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RXA实验吋应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应，㈥而含Tris和1HT的试剂不能用DEPC处理(一)动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的纟II织或培养细菌，样品:5:从几十毫克至几克。川Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N屮磨成粉末后，再以50-100mg组织加入

5、lmlTrizol液研磨，注意样品总体税不能超过所用Trizol体职的10%。2、研磨液室温放置5分钟，然后以每lmlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异W醇，室温放置10分钟,12000g离心10分钟。4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀，4°C下7500g离心5分钟。5、小心弃去上淸液，然耵室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要吋可55'C-60°C水溶1

6、0分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70X［注意］1、整个操作要带U罩及一次性手套，并尽可能在低温卜_操作。另外，提取上淸这步一定耍小心，靠近沉淀的部分一定要贪得不要，耍不然会有蛋白质污染，影响比值2、加氯仿前的匀浆液可在-70°C保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇屮可在4°C保存一周，-20°C保存一年。总mRNA的提取（ft己的经验）一、关于TrizolReagent需要的试剂1.Chloroform：気访（分析纯）2.Isoproplylalcohol：异内醇（分析纯）3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）:75%乙醇。要求

7、用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4.RNase-freewater：无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%（V/V）加在dH20中500ml（50ul）,在37°C过夜，并髙压火荫即得（150°C3小吋）5.一次性頌料手套6.注意：DEPC有致癌之嫌_1、关于TrizolReagent的使用过程：1.Homogenization（匀浆）a.Tissues：组织每100mg组