real-time pcr实验注意事项

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1、Real-timePCR实验注意事项实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1.  所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2.  塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.  有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，

2、乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.  配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.  操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.  设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑

3、制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质

4、和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理（一）动植物总RNA提取-Trizol法　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Tri

5、zol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10

6、分钟。　　4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。　　[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，R

7、NA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。总mRNA的提取(自己的经验)一、  关于TrizolReagent需要的试剂1．  Chloroform：氯仿(分析纯)2．  Isoproplylalcohol：异丙醇(分析纯)3．  75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4．  RNase-freewater：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压

8、灭菌即得（150℃3小时）5．  一次性塑料手套6．  注意：DEPC有致癌之嫌二、  关于TrizolReagent的使