【周凌云】茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

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1、茶炭疽病的分子检测及病原鉴定周凌云王沅江黄安平曾振刘红艳（基金项目：湖南省农业科学院创新项目作者简介：周凌云（1978—），女，湖南邵阳人，助理研究员，博士研究生，主要从事茶树病害研究，zhoulingyun0808@126.com湖南省茶叶研究所，长沙410125）摘要：根据茶炭疽病菌与其它菌ITS序列的差异设计了1对寡聚核苷酸引物，并优化DNA抽提方法与扩增条件，从而实现了病叶准确而快速的PCR检测。分离到两种病原菌Z1、Z2通过形态鉴定与回接实验初步鉴定为茶炭疽病菌，并在核酸体转录间隔区序列（GITS、ITS）及肌动蛋白基因（ACT）3对引物的多基因分子联合检测实验中再次被证实。关键词

2、：茶炭疽病；分子检测；病原；鉴定；症状MolecularDetectionandPathogenIdentificationofTeaAnthraxZHOULingyun,WANGYuanjiang,HUANGAnping,ZENGZhen,LIUHongyanHunanTeaResearchInstitute，Changsha410125Abstract：Accordingtothesequenceofinternaltranscribedspacerregions(ITS)oftheribosomalgene，apairofspecificprimersforthepathogenofT

3、eaanthracnosewassynthesized．WiththeoptimizationofreactionconditionsandamplificationStudy,weprovidedaaccurateandrapidmethodtodetectthepathogen.Z1、Z2wereisolatedandbeenpreliminaryidentifiedastwodifferentpathogensofteaanthracnosebymorphologicalidentificationandtiebackexperiment,Theconclusionwastestifi

4、edagainbymoleculardetectionofthreeprimes(GeneralITS,ITSandActingenegene).Keywords:Teaanthracnose；Moleculardetection；Pathogen；Identify；Symptom7茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到

5、及时高效的防控，自2009年，本研究组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后[1]，再次进行自然病样的直接分子检测，并分离获得两种菌落形态差异很大的病菌，分别命名为Z1、Z2，经过形态学与分子鉴定明确Z1、Z2为茶炭疽病的致病菌。1材料与方法1.1供试病叶及来源长沙县茶园随机采集20片显症为红褐色病斑的茶叶与20片显症为灰白色病斑的茶叶。1.2病原菌分离、回接与形态学观察选取病叶病健交界处组织100块，约2mm×2mm，75%酒精中浸泡5秒钟，3%次氯酸钠溶液灭菌1分钟，无菌水洗3次，置于PDA培养基上，放入28℃培养箱中培养，单孢分离得到纯孢子培养于PDA上，记录病原菌的菌落形态、分生孢子的

6、形状、颜色、大小等。借鉴Yoshida，K，2004[2]的接种方法，利用打孔器将PDA上培养5天的菌落打成菌碟，置于挑针戳了2个伤口的茶叶上，脱脂棉蘸无菌水保湿，分别接种于室内的ROOTCUBES®生长介质(Smithers-Oasis有限公司)中保持高湿、26℃与田间枝条茶叶上用保鲜袋连续保湿3天，设置3个重复，对照接无菌培养基，其他操作相同，每天观察1次发病情况，将已产生症状的叶片进行切片棉兰染色观察。1.3病原菌分子生物学鉴定根据茶炭疽病菌与其它菌属ITS序列的差异，应用DNAStar的PrimerSelect设计了1个ITS引物对，与来自文献[3-4]的GITS、ACT的这2个引物

7、一起交付华大生物有限公司合成，3个引物对见表1。表1选择的目标基因及相应的引物名称引物GITSITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGCITSITSF：TTACGTCCCTGCCCTTTGTA，ITSR：AATGTGCGTTCAAAGATTCGACT512F：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC，783R：TACGAGTCCTTCTGGCCCAT7