一株石榴炭疽病病原真菌的鉴定.pdf

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1、第二十九卷第三期楚雄师范学院学报Vo1．29No．32014年3月JOURNALOFCHUXIONGNORMALUNIVERSITYMar．2014一株石榴炭疽病病原真菌的鉴定李秀丰，谢美华，李雪玲，杨海艳’(1．楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄675000；2．云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201；3．云南省高校应用生物学重点实验室，云南楚雄675000)摘要：为了解石榴炭疽病病原，采用形态学结合多基因系统学的方法对其进行鉴定。结果表明：该菌为喀斯特刺盘孢CoUetotrichumkarstii，分生孢子直，单孢，无色，

2、圆柱形，顶端钝圆，大小为14．6(12．3～16．3)×6．6(6．1～7．3)Ixm，长宽比在1．9～2．6之间，平均为2．2。附着孢圆形至近椭圆形，简单，淡褐色，全缘，大小为7．1(5．3～8．7)×5．3(4．9～5．7)m。本文为该菌在石榴科植物上的首次报道。关键词：石榴；喀斯特刺盘孢；病原菌鉴定中图分类号：$436．65文章标识码：A文章编号：1671—7406(2014)03—0053—06石榴科(Punicaceae)亦称安石榴科，全世界共有1属2种，产于地中海至亚洲西部地区。我国引人栽培1种，即石榴Punicagranatum。石榴在南北各省都有分布，根

3、据花的颜色以及重瓣或单瓣等特征又分为若干栽培变种_1J。石榴的根、叶、花、果皮、种子均可人药l3]。近年大量研究表明，石榴具有抗氧化、预防心血管疾病、抗菌、抗感染等诸多功效，这与石榴中含有较高的抗氧化活性物质有关J。然而，石榴干腐病、褐斑病、桃蛀螟、炭疽病、蚜虫、介壳虫、吸果夜蛾等病虫害常造成石榴树大量落叶，影响树势和产量J。石榴炭疽病会导致光合作用和吸收代谢受到制约和影响，影响石榴的品质，甚至引起植株死亡，造成经济损失。炭疽病的病原菌主要是刺盘孢菌，刺盘孢寄主范围非常广泛，可在多种植物体上繁衍生长，该病具有潜伏性，难以早期诊断、早期防治，因此一旦暴发流行，很难控制和治

4、愈r71引。由于刺盘孢菌有的种寄主广泛，形态多变，分类系统复杂，根据寄主专化性、形态学等特征进行种级鉴定对初学者而言比较困难。近年来，分子技术在刺盘孢属内种间的鉴定和分类上取得了巨大进展，如测定炭疽菌ITSrDNA序列差异、RAPD法、PCR—RFLP法、AFLP法、基因组DNA的AT富集区分析法等_9J。随着分子生物学的发展，刺盘孢菌分类研究中，形态学结合多基因联合分析已成一种趋势¨MJ。虽然石榴炭疽病在我国时常报道，但其病原究竟是什么未见记载，故本研究采取形态学结合多基因联合分析，对石榴炭疽病的病原进行鉴定，为石榴炭疽病的防治提供理论基础。基金项目：云南省重点建设学

5、科，楚雄师范学院重点建设学科基金项目(05YJJSXK03)；云南省高校科技创新团队支持计划项目(IRTSTYN)；楚雄师院院级项目(05一YJRC04)；楚雄师范学院大学生创新创业训练计划项目(2013cxcy04)。收稿日期：2014—02—08作者简介：李秀丰(1989一)，女，云南姚安人，大学本科，主要研究方向：应用生物学实验。·53·楚雄师范学院学报2014年第3期楚雄师范学院学报2014年第3期1材料与方法1．1材料取患有炭疽病的石榴果，用组织培养法分离病原菌，采用科赫氏法则确定其病原，菌株编号yn058。1．2方法1．2．1形态观察及鉴定对患有炭疽病的石榴

6、果进行形态观察，并记录其形态特征。分离得到的纯培养物，单孢一代或二代于PDA培养基25℃培养7d，观察菌落形态及生长率、颜色和产孢情况等性状，同时观察分生孢子及附着孢的形态特征并记录。1．2．2分子生物学鉴定用CTAB法提取真菌基因组DNA，选择的目的基因分别为核糖体转录间隔区序列(internaltranscribedspacers，ITS)、13一微管蛋白基因(p—tubulingene，TUB2)、3一磷酸甘油脱氢酶基因(glyeeraldehydes一3一phoaphatedehydrogenasegene，GPDH)和几丁质合成酶A基因(chitinsyn—t

7、haseAgene，CHS1)进行扩增与测序，相应的PCR扩增引物见表l。ITS反应体系为50L，包含缓冲液(10×buffer)41xL；MgC12(25mM)4IxL；dNTPs(1OmM)0．8L；Primer1(10pM)2L；Primer2(10pM)2L；Taq酶(5U／p~L)0．41xL；模板DNA(20ng)21xL；ddH2034．8L。再覆盖上20txL矿物油，以防蒸干。TUB2、ACT、CAL反应体系为50L，共包含缓冲液(2×buffer)25IxL；dNTPs(2mM)10p~L；Primer1(10pM)1L