SNT1129.2-2002牛病毒性腹泻粘膜病病毒分离操作规程.pdf

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1、牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离操作规程Protocolofvirusisolationforbovineviraldiarrhea／mucosaldiseaseSN／T1129.2—2002前言本标准中有关病毒分离和鉴定方法是参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践经验的基础上制定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：周晓黎、花群义、徐自忠、徐维加。本标准系首次发布的出入境检验检疫

2、行业标准。1范围本标准规定了牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离和鉴定方法。本标准适用于动物感染牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。CPE致细胞病变作用。TCID50半数组织培养感染量

3、。BVD／MD牛病毒性腹泻／粘膜病。SPF无特定病原体。4原理动物感染BVD病毒并产生抗体后，在较长一段时间里病牛的许多组织中有病毒的存在，急性病例具有持续的病毒血症，所以血液是最好的病毒分离材料，采取凝固的血块，经冻融几次后作为接种物。尸体剖检时则采取肠系膜淋巴结或脾脏，也可应用骨髓经常规处理后作为接种物。发病较久或怀疑有抗体存在时，用上述病料分离病毒，可能会受到干扰，此时可采抗凝血，分离白细胞作为接种物更为理想，检查局部感染时，可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物。各种牛源细胞均可用于病毒分离，包括牛肾和胎牛肺原代

4、细胞或继代细胞以及犊牛睾丸细胞。犊牛原代睾丸细胞常可显示较好的细胞病变。分离株若引起细胞病变，则应进一步用抗BVDV的免疫血清进行中和试验鉴定。若无细胞病变，则用免疫荧光抗体试验(FA)，免疫过氧化物酶试验、中和试验等方法进行鉴定。病料接种于敏感细胞后至少应传两代以上，方可进行鉴定。5试剂和材料5.1水：本标准所用水应符合GB／T6682中二级水的规格。5.2病毒：BVD病毒OregonC24V。5.3血清：BVD标准阳性血清、阴性血清。5.4被检样品：凝固的血块、肠系膜淋巴结或脾脏、骨髓、白细胞、分泌物或排泄物，经

5、研磨冻融几次后作为接种物。若需要长途运输，应将病料置入含有高浓度抗生素的运输液中(每毫升5000IU青霉素，5000μg链霉素和10μg两性霉素B)。5.5细胞：试验所用的细胞为原代或次代犊牛肾细胞或睾丸细胞，一般不超过四代，按常规胰酶消化方法制备(所用犊牛应无BVD污染)。5.6培养液：199培养液，生长液中加10％犊牛血清，维持液中加3％(或无)犊牛血清(使用前应检查血清不含BVD抗体和无BVD病毒污染)，含青霉素200IU／mL、链霉素200μg／mL。5.7细胞分散液：0.25％胰蛋白酶。5.8碳酸缓冲液甘油

6、：配方见附录A.9。5.9丙酮。5.10FITC标记的BVD／MD病毒抗体。5.11带盖的湿盒。6器械和设备6.1乳钵或组织捣碎器。6.2载玻片和盖玻片盖玻片为18mm×18mm×0.17mm，用砂轮切划成适当大小的飞片，按细胞培养用玻璃器皿的洗涤和处理方法处理后备用。6.3超声波裂解器。6.4倒置显微镜。6.5荧光显微镜。6.6微型振荡器。6.7二氧化碳培养箱。6.8冰箱-20℃保存血清，-70℃保存种毒。6.9组织培养板(96孔或24孔)。6.10单头和多头微量移液器及滴头20μL～200μL。7病毒分离用含10

7、％犊牛血清的199营养液制作犊牛原代或次代睾丸和肾细胞，在24孔板中培养。每孔加入1mL细胞悬液(细胞浓度为1×105个／mL)，置37℃、5％二氧化碳培养箱培养，24h内长成单层细胞。在每孔加入100μL样品，加盖用振荡器轻振。置37℃、5％二氧化碳培养箱中吸附1h。然后每孔加1mL维持液，37℃、5%二氧化碳培养箱培养6d。在培养第5天、第6天观察CPE，如有50％以上细胞出现CPE，收获该孔培养物，低温保存备用。如不出现CPE，6d后将培养物冻融二次至三次，并将同一样品两孔细胞培养物混合4℃保存备用。阳性对照(

8、接种BVD病毒)两孔，阴性对照(细胞对照)两孔。8病毒鉴定8.1直接免疫荧光抗体染色8.1.1样品制备24孔板每孔加入一片飞片，然后加入制作好的原代细胞悬液(或直接用96孔培养板进行细胞培养)，待长成单层细胞。吸出孔内培养液，每孔接种第一代培养解冻物0.1mL，每份样品两孔，加盖，用振荡器轻振，置37℃、5％二氧化碳培养箱吸附1h，每孔加维持液