SNT1686-2005新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法.pdf

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1、新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法SN/T1686-20051范围本标准规定了新城疫中强毒株TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于禽类及其产品新城疫病毒中强毒株的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方

2、法3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1荧光RT-PCR荧光反转录-聚合酶链反应。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数。3.3RNA核糖核酸3.4Taq酶TaqRNA聚合酶3.5PBS磷酸盐缓冲生理盐水3.6DEPC焦碳酸乙二酯。4原理采用TaqMan方法，在比对新城病毒F基因序列的基础上，设计针对F基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3’端标记TAMPA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧

3、光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的1荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5检测实验室的设备与管理中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1-2004附录C。6试剂和仪器6.1试剂除另有说明，所有试剂均为分析纯；所

4、有试剂均无RNA酶的容器分装。6.1.1三氯甲烷。6.1.2异丙醇：-20℃预冷。6.1.375%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20℃预冷。6.1.40.01mol/L(pH7.2)的PBS：配方见附录A。（121±2）℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链毒素各10000IU/ML。6.1.5中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。6.2仪器设备6.2.1高速台式离心机：最大离心力12000r/min以上。6.2.2荧光P

5、CR检测仪、计算机。6.2.32℃-8℃冰箱和-20℃冰箱。6.2.4微量移液器：0.5ul-10ul,5ul-20ul,20ul-200ul,200ul-1000ul。6.2.5组织匀浆器。6.2.6混匀器。7样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7.1取样工具7.1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendort管。27.1.2所有上述取样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。7.2采样方法7.2.1活禽样品7.2.1.1咽喉拭子采样，采样时

6、要将拭子深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次-5次，取咽喉分泌液。7.2.1.2泄殖腔棉拭子采样，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。7.2.1.3将采样后的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0mlPBS的Eppendorf管中，编号备用。7.2.2内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mlPBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10mlPBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌Eppendorf管中，编号备用。7.2.3血清或血浆

7、用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。7.3存放与运用采集或处理的样本在2℃-8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8操作方法8.1样本核酸的提取在样本处理区进行。8.1.1取n个1.5ml灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8.1.2每管加入600ul裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200ul，一份样

8、本换用一个吸头，再加入200ul三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。38.1.3取与8.1.1中相同数量的1.5ml灭菌Eppendorf管，加入500ul异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取8.1.2离心后各管中的上清