DB22∕T 3031-2019 禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3031—2019禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法OnestepfluorescentRT-PCRmethodforsimultaneousdetectionoftheAIVand本标准仅供内部使用不得翻印NDV2019-05-27发布2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3031—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧

2、业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林大学。本标准起草人：尹仁福、刘新鑫、丁壮、李俊娇、费亦东、范钦磊、肖玉海。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3031—2019本标准仅供内部使用不得翻印禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测法1范围本标准规定了禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设备、样品、检测方法和结果。本标准适用于禽流感和新城疫病毒检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本

3、（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3原理本标准仅供内部使用不得翻印通过提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，最终计算待测样品模板的初始浓度。4试验条件4.1生物安全要求所有培养物和废弃物的处置应按照GB1

4、9489中的有关规定执行。4.2防污染措施4.2.1防止污染措施应符合GB/T27401的规定。4.2.2实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域，避免不同工作区域内的设备、物品混用。每一个区域应有专用的仪器设备。5试剂或材料5.1试剂除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。1DB22/T3031—20195.1.1磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液pH值范围为pH7.0〜pH7.4，成分为青霉素2000U/mL、链霉素2mg/mL、卡那霉素50µg/mL、制菌霉素1000U/mL。5.1.2RNA提取试剂盒。本标准仅供内部使用不得翻印5.1.3荧

5、光探针RT-PCR试剂盒。5.1.4采用无新城疫、禽流感病毒的阴性质粒作为阴性对照。5.1.5采用无RNA酶灭菌超纯水作为空白对照。5.1.6采用已构建出的新流感、新城疫病的的阳性质粒作为阳性对照。5.2材料5.2.1棉拭子。5.2.2雏禽新鲜粪便。5.2.3死禽。采取病料包括脑、肺脏、脾脏。5.2.4离心管。1.5mL。5.2.5微量移液器枪头。1000µL、200µL、10µL。5.2.6荧光PCR管。5.3引物引物及浓度见表1。本标准仅供内部使用不得翻印表1荧光定量PCR方法所用引物和TaqMan探针序列靶基因引物探针序列（5’～3’）碱基数工作浓度Ftatacgactcac

6、tatatcttctaaccgaggtcgaaacg39禽流感Rttcttccctgcaaagacatcttc23检测引物Pfam-ccctcaaagccgagatcgcgc-tamra21引物10µmol/LFtatacgactcactatattgccagcacaaaaaggtctcc39探针90µmol/L新城疫Rtcatcaccacctatccattcatctt25检测引物Pvic-cttcctaggcagagcat-tamra176仪器设备6.1组织匀浆器。6.2旋涡振荡仪。6.3高速冷冻离心机。16000r/min。6.4冰箱。-80℃、-20℃、4℃。6.5微量移液器。

7、6.6荧光定量PCR仪。StepOne型。7样品7.1采集7.1.1活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子（5.2.1），后者需带有可见粪便。雏禽可采用收集新鲜粪便（5.2.2）代替。2DB22/T3031—20197.1.2死禽以脑、肺脏、脾脏（5.2.3）为主，也可采集其他病变组织。7.2处理本标准仅供内部使用不得翻印气管和泄殖腔拭子（5.2.1）放入PBS（5.1.1）中，4℃保存（6.4）。粪便（5.2.2）和搅碎（6.1）的组织，用PBS（5.1.1）制成10