原料乳中多种致病菌的快速过滤富集及多重pcr检测

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1、原料乳中多种致病茵的快速过滤富集及多重PCR检测吕琦，赵凤，毕宇涵，张光辉，周艳秋，遇晓杰。，张剑峰。，姜毓君。l(乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨，150030)2(国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨，150086)3(黑龙江省疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨，150O30)摘要针对目前原料乳中致病菌的检测方法繁琐费时耗力的缺点，建立一种能同时检测原料乳中多种致病菌的快速检测方法，采用多重PCR快速灵敏检测技术与一种不需要预增菌就可以直接从原料乳中快速过滤富集菌体的技术相结合来同时检测原料乳中主要致病菌一一沙门氏菌、大肠杆菌015

2、7：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌和蜡样芽孢杆菌。整个过程只需7～8h即可完成，且检测灵敏度可达10。cfu／mL。这种方法是对传统检测方法的有效改进，并且达到了原料乳检测快速、准确、灵敏的要求。关键词多重PCR，原料乳，致病菌，过滤，快速检测牛乳作为一种被人们广泛食用，并且是加工食品技术都存在一个问题：即1次实验只能检测1种病原原辅料的重要动物源性食品品种，是人类最理想的营细菌，而乳样品中往往存在的致病菌种类很多，有可养食品之一，人们对乳及乳制品的需求也在逐年增能涉及不同种和型的细菌。因此近年来出现了一些加。然而牛乳也是一种最易遭受病菌污染而腐败变1次实

3、验能同时检测多种致病菌的检测方法，多重质的食品之一。乳制品中造成大规摸人群食源性疾PCR(multiplexPCR)就是其中一种，此项技术的应病暴发的主要致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆用有效地克服了以上技术的缺点，可以同时检测多种菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、布鲁氏杆菌、志贺氏致病菌，其快速、简便、灵敏度高，并且能够满足实验菌、蜡样芽孢杆菌等。l994年美国暴发了由沙门氏室快速检测的要求。菌造成的冰淇淋污染，约有22400人患病。2000年但是应用多重PCR技术通常需要8～12h的预日本大阪市爆发了由金黄色葡萄球菌造成的乳制品增菌时间，这就无形中给应用此技术对

4、原料乳进行快中毒事件，发病者达10682人。2001年在江苏、安徽速检测增添了一些不足，为了弥补这样的缺陷我们采等地暴发的肠出血性大肠杆菌O157：H7食物中毒用了一种新的过滤技术来快速富集原料乳中的致病造成177人死亡，中毒人数超过2万人。此外，世界菌菌体。一般来说，牛乳中的蛋白质和脂肪是阻遏过各地仍有因致病菌的存在而导致乳制品中毒事件的滤的主要因素，为了克服这些因素，采用离心脱脂后频频发生。这些事件的发生无不说明了检测乳中致再用EDTA处理乳中的蛋白质，然后进行快速过滤病菌的重要性。富集。采用此过滤技术富集菌体有快速、简便、成本目前，国内外对乳中致病菌的检验

5、大多延用培养低等优点。由刘伟等人L1]最先采用此技术对原料乳法进行检测，这种方法存在着操作繁琐、时间长、灵敏中沙门氏菌进行研究，本实验又进一步对原料乳中5度低、容易出现假阴性等缺点。乳胶凝集法、免疫磁种混合菌体进行了过滤。珠分离法、酶免疫测定等免疫学方法虽然能弥补传统方法的一些不足，但也存在误差大、周期长的局限性。1材料与方法用基因探针检测则存在检测费用昂贵的缺点。现在1．1材料国内外以研究PCR技术来检测致病菌较多，但这些1．1．1菌株金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC13565)、沙门第一作者：硕士研究生(姜毓君为通讯作者)。氏菌标准菌株(ATCC14028)

6、、单增李斯特菌标准菌*国家科技支撑计划(2006BAD04A08—13)；教育部科学技术研株(CMCC54006)，中国药品生物制品检定所；蜡样究重点项目(208036)；黑龙江省科技攻关项目(GA06C101—08)；黑龙江省科技攻关项目(GC04C42501)芽孢杆菌标准菌株(ATCC7064)；大肠杆菌O157：收稿日期：2008—07—24，改回日期：2008—09—05H7标准菌株，东北农业大学微生物学教研室。堡蔓鲞蔓塑(篁篓塑)I’55FOODANDFERMENTAT10NINDUSTRIE1．1．2主要试剂1．2．4多重PCR产物的测序牛乳：市售未

7、加工的原料乳。琼脂糖凝胶电泳检测5种致病菌多重PCR结果引物：由上海英骏生物技术有限公司合成，Taq并将扩增的目的片段回收，回收片段与pMG19一TDNA聚合酶、dNTPS、100bpDNAMarker、细菌基因连接，反应体系按产品说明书建立，后将载体转化至组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；其他宿主菌大肠埃希菌JM109进行菌体培养，然后进行试剂均为市售分析纯试剂。微孔滤膜：浙江省海宁市蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，后提交测序。盐官众联过滤器材厂。1．2．5原料乳的人工污染与过滤前处理1．1．3主要仪器设备将5种致病菌等浓度混合菌液人工污染到200A

8、BI9700PCR仪，美