食品致病菌的多重pcr检测分析

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1、食品致病菌的多重PCR检测分析关桂英王风朝山东莘县疾病预防控制中心检验科，山东莘县252400[摘要]目的研究食品的有效检测方法以及对食品中毒的诊断。方法通过对六种造成食物中毒的主要病菌进行比较研究，建立PCR检测体系，与常规聚合酶链反应对比，以研究多重PCR检测在食物检测中的应用。结果多重PCR检测以及常规PCR检测事宜的退火温度分别为62°C和58°C，常规PCR检测敏感度为2×10-2~2×10-7ng/μL，多重PCR的检测敏感度是2×10-2~2×10-6ng/μL，相对而言常规PCR检测能更为准确的检测食物中的致病菌。结论主要致病的6种细菌类型能够在一次检测中被查出，PC

2、R检测有众多的检测优势，因此应该在食品致病菌的检测工作中推广应用，从而保证食品食用安全。[.jyqkega公司。试剂盒为琼脂糖DNA纯化试剂盒，由青岛生物科技公司制作，6对主要对引物均来自上海生物科技公司。1.1.2检测仪器包括Centri-fugeFRESCO17低温告诉离心机、DYY-6C电泳仪器、HDLⅡ生物安全柜、SPX-250B-Z培养箱、超纯水以及凝胶成像系统。1.1.3菌种类型包括蜡样芽孢杆菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、肠毒性大肠埃细菌、血性弧菌、葡萄糖细菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌，均由本市疾控中心提供。1.2一般方法1.2.1菌株培养将沙门菌融于氯化镁孔雀绿肉汤中，保

3、持37°C的温度持续培养1d；志贺菌接种于GN增菌液，保持37°C培养1d；肠毒性大肠埃希菌与营养肉汤相接种，同样维持37°C的温度培养1d，副融血性弧菌与碱性蛋白胨水相接种，保持37°C培养18h，葡萄球菌与胰蛋白胨大豆肉汤，保持37°C培养1d，蜡样芽孢杆菌与胰酪胨大豆多黏菌素肉汤，保持37°C培养约20h。1.2.2PCR引物设定首先根据美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库明确6种微生物的DNA序列，利用DNA序列数据库的众多资源研究特异属性，后开展靶序列选取，找到这6中致病细菌的对应PCR引物，当引物设计完成后利用Blast能够计算两个序列中具有相似性序列的功能，挑

4、选出与DNA序列数据库的同源性低于40%的PCR引物，并且保证两者的特异性。1.2.3样品采集主要采集100例食物中毒患者的呕吐、腹泻物共计146份，还包括携带病菌的食物或饮品。1.2.4常规PCR反应循环参数首先保持温度在95°C，持续3min，单个循环过程温度保持94°C，时长30s，一共反映35个循环，待58°C时停火1min，而72°C时延伸1min，等循环完成后，延伸10min，使温度下降至16°C，4°C时存储产物，以便于下次使用。利用凝胶成像系统和3%琼脂糖凝胶电泳检查5μLPCR产物，剩下的均4°C进行保存。1.2.5常规PCR退火温度控制基于6种主要致病细菌的退火温

5、度设定PCR反应的退火温度范围在50~62°C，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，后通过电泳图条带的亮度反映来控制退火温度。1.2.6多重PCR反应循环参数保持95°C下预变性3min，持续40个循环，每一循环维持94°C变性30s，62°C停火1min，同样于72°C时延伸1min，40个循环均完成后延伸10min，待其冷却到16°C，4°C时存储产物，同样利用凝胶成像系统和3%琼脂糖凝胶电泳检查5μLPCR产物，剩下的均4°C进行保存。1.2.7多重PCR退火温度控制以肠毒性大肠埃细菌、蜡样芽孢杆菌以及副溶血性弧菌为例，基于多重PCR反应系统设计以上三种病菌类型的退火温度为48~

6、72°C，同样使用琼脂糖凝胶电泳检测方式，根据电泳图条带呈现的亮度情况选择适当的退火温度。1.2.8常规以及多重PCR检测敏感度对比测定选取的葡萄球菌、肠炎沙门菌和蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA浓度，并且使其变为20ng/μL，并且进行十倍稀释，保证敏感度测验的DNA浓度在2×10-2~2×10-10ng/μL，后在每个浓度中各选择2μl进行常规以及多重PCR检测对比。2结果2.1常规PCR检测与多重PCR检测灵敏度对比结果通过常规PCR检测和多重PCR检测的敏感度比较，经过10倍稀释后的葡萄糖菌、蜡样芽孢杆菌标准菌株基因组DNA、肠炎沙门菌得知，常规PCR在DNA含量较低的情况下

7、仍旧可以反映出清晰特异性的目的条带，而多重PCR只能扩增出葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌，当DNA浓度低于2×10-2~2×10-1ng/μL时，无法检测出蜡样芽孢杆菌，而低于2×10-2~2×10-3ng/μL时，只等对葡萄球菌进行扩增，DNA浓度不高于2×10-2~2×10-7ng/μL时候无法扩增。由此得知常规PCR检测敏感度为2×10-2~2×10-7ng/μL，多重PCR的检测敏感度是2×10-2~2×10-6ng/μL。对100例患者146份食品中毒