cdna第一链合成试剂盒说明书

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1、杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园金蓬街366号1幢东4F邮编：310030电话：0571-87381295传真：0571-87381297cDNA第一链合成试剂盒说明书产品组成cDNA第一链合成试剂盒Cat.No.25次制备7306025100次制备73061005×gDNABufferRNase-FreeddH2O5×RTBufferRTEnzymeMixRTPrimerMix60μl1.5ml110μl60μl110μl220μl1.5ml×2420μl220μl420μl产品储存

2、与有效期-20℃保存有效期为壹年。技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail:technical@simgen.cn,电话：400-0099-857。产品介绍本试剂盒是一种高效、快速并可以去除基因组DNA污染的反转录系统，操作步骤简单，可在半小时内完成cDNA第一链的合成，非常适合荧光定量PCR及普通RT-PCR实验。本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase；通过42℃，3min即可去除gDNA，有效避免了总RNA中基因组DNA的干扰。本试剂盒所含的高效反转录酶RTEnzyme，42℃，15mi

3、n即可完成cDNA第一链的合成。本试剂盒还具有与RNA模板高亲合性的特点，能通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。用户需自备的试剂与物品1．水浴锅或普通PCR仪2．冰浴3．RNase-free的PCR管4．移液器及RNase-free吸头5．一次性手套及防护用品和纸巾6．台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子）注意事项：1）以下操作步骤请在冰浴上进行，以避免RNA降解。2）对于二级结构非常复杂的RNA模板，推荐将模板RNA在65℃孵育5分钟后迅速转移到冰浴中，再进行cDNA的合成。3）RT

4、PrimerMix中含有Oligo-dT和随机引物，如果用户需要单独使用Oligo-dT或者基因特异性引物，请按Oligo-dTPrimer50pmol/20μl；或者反向基因特异性引物5pmol/20μl的比例加入引物，并将加入引物的体积用RNase-FreeddH2O调整为4μl后替换RTPrimerMix。www.simgen.cn仅供科研使用，请勿用于人体及动物的治疗或临床诊断。Ver.4杭州新景生物试剂开发有限公司区地址：浙江省杭州市西湖科技经济园金蓬街366号1幢东4F邮编：310030电话：0571-

5、87381295传真：0571-87381297操作步骤：以下操作步骤适用于模板量为50ng-2μg的总RNA，如果总RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。1.将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、RNase-FreeddH2O、5×RTBuffer、PrimerMix、在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。2.按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。*RNA

6、的完整性对逆转录非常重要，若RNA模板被降解，将导致cDNA产物减少，或者不能扩增长片段的基因。表1gDNA去除反应体系5×gDNABuffer2μlTotalRNAnμl(50ng-2μg)RNase-FreeddH2O(8-n)μl3.按照表2的反转录反应体系配制混合液。*如果一次性要合成多管不同的cDNA，可预先按倍数将反转录反应体系中的各个组分加入到一个PCR管中并混匀，然后再按10μl/管的量分装到gDNA去除反应体系中，以减少实验误差。表2反转录反应体系5×RTBuffer4μlRTEnzymeMix2

7、μlRTPrimerMix4μl4.将反转录反应体系中的混合液，加到gDNA去除反应体系的混合液中，充分混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。5.42℃，孵育15min。6.95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或-20℃低温保存。*步骤5、6可在PCR仪上完成。*若后续实验为实时荧光定量PCR，cDNA的加样量不应超过PCR体系终体积的1/10，例如50μl的PCR反应体系，cDNA的加量应不超过5μl。*如果cDNA用作荧光定量PCR时，未呈现标准的“S”形曲线，可能是cDNA的浓度过

8、高而影响背景荧光的采集，建议将得到的cDNA稀释2-5倍后再进行荧光定量PCR实验。www.simgen.cn仅供科研使用，请勿用于人体及动物的治疗或临床诊断。Ver.4