实验六、农杆菌介导转化拟南芥

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1、实验六、农杆菌介导转化拟南芥实验目的：学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理。实验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥的实验方法，了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。技术应用：一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。实验材料：农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300，拟南芥试剂：YEB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；转化介质：1/2MS大量，1×铁盐，1×微量，1×有机，5%蔗糖，0.01µg/ml苄氨基嘌呤(BA

2、P)，0.03%silwetL-77，20mg/L乙酰丁香酮，KOH调pH值至5.7。1.1简介：拟南芥（Arabidopsisthaliana）是一种十字花科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：（1）形态个体小，生活力强,种子量大；（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6--8周；1拟南芥（3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因

3、；（4）拟南芥是自花授粉植物，易于获得纯合突变体。1.2拟南芥的培养：将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养1-2周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1）混合物上培养。注意：湿度要大一些。2.转化原理2.1农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。2.2根癌农杆菌含有Ti  (tumor-inducingplasmid)质粒，Ti质粒上的T-DNA（transferredDNA）在Vir区（virulenceregion）基因产物的介导下可以插

4、入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将外源目的基因插入到T-DNA中，借助Ti质粒的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步整合、表达。Vir区2.3双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。另一部分是微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基因或LacZ基因等。双元载体系统的转化原理是Ti

5、质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的转移。外源基因切外源基因T-DNA整合进基因组DNA3转化方法根据受体材料不同分为浸花法、原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。其中浸花法、叶盘法在许多植物上得到广泛应用。实验流程1.挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌株至5ml新鲜YEB液体培养基（50g/mlKan，125g/mlRif）中，28℃摇培24h。2.取上述菌液0.1ml接至50ml新鲜YEB液体培养基（50g/mlKan，125g/mlRif）中，28℃220rpm培养2～4h

6、，使OD值达到0.8左右。3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min，弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。4.将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中，加入上述转化液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好标记。农杆菌介导转化拟南芥转化后的管理在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足horgland营养液，恢复正常培养。为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目的质粒

7、的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。说明转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后，放于1.5ml新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。