实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥

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1、实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥ArabidopsisthalianaNicotianatabacum选择标记基因与报告基因必备条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶基因较小能在转化体中得到充分表达检测容易，并且能定量分析选择标记基因与筛选标记基因：npt-II新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）报告基因：reportgene（筛选标记之一）在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能在转化细胞中得到

2、表达，起到报告的作用。gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因）转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。植物基因转化受体高效稳定的再生能力较高的遗传稳定性具有稳定的外植体来源对选择性抗生素敏感对农杆菌侵染有敏感性植物基因转化受体系统类型：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞受体系统植物遗传转化方法植物遗传转化农杆菌介导法基因枪法PEG诱导原生质体电穿孔法操作简单，易造成原生质体损伤双子叶植物无宿主限制，技术限制原生质体培养转基因方法农杆菌侵染法基因枪法农杆菌侵染

3、法农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系对单子叶植物不敏感根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。T-DNA整合植物基因组的分子机理T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。插入位点特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，T-DNA

4、的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。真空浸透法转化拟南芥受体材料拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前一天去除已开花蕾和果荚接种接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5mLYEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡培养过夜活化将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif100μg/mL，

5、Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2诱导收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015%SilwetL-77)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8转化将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽真空10min培养将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2d后去除塑料膜，培养至种子成熟农杆菌侵染瞬时转化烟草接种接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5mLYEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28

6、°C，200rpm振荡培养过夜活化将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡培养至菌液OD600为1-2诱导5000rpm离心5min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8侵染烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件

7、下培养2d。注射法瞬时转化烟草受体材料种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25°C，16h光照，约一个月后可用；在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；接种与活化小量培养农杆菌16-24h；按1:100转接到培养液(5mLYEP，100µM乙酰丁香酮(Aldrich)，10mMMES(pH5.6)，Rif100μg/mL，Kan50μg/mL）中，28°C16-24h诱导当菌摇到OD6001.0时，5000rpm10min收集菌体，用溶液(5ml10mMMgCl2，7.5μL100mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD60

8、01.0，室温静置至少3h侵染用1ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48h后，Gus染色观察乙酰丁香酮Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具有重要作用。