酶免疫技术—医学课件

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1、酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点基本原理：Ab+EAb-E+AgAgAb-E+底物显色Ag+EAg-E+AbAgAb-E+底物显色该实验利用了酶催化底物的生物放大作用，可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。相结合的技术酶标记免疫技术又称酶免疫技术：抗原抗体反应的特异性酶促反应的专一性应用评价：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染，不需特殊设备。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点:免疫学活性不变;酶对底物的催化活性不变。辣根过氧化物

2、酶（HRP）从辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基），主酶与酶活性无关，辅基是酶的活性中心。优点：分子量小，标记物易透入细胞；标记方法简单；溶解性好；价格低且有商品供应；底物种类多。由于有以上优点，因此，是ELISA最常用的酶。常用酶酶和酶作用底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2OHRPDH2为供氢体习惯上被称为底物，底物有多种酶和酶作用底物HRP催化的反应式H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。常用的是过氧化氢（H2O2)和过氧化氢尿素（CH6N2O3)，过氧化氢很不稳定需用前临时配制。过氧化氢尿素配制成应

3、用液可长期保存。HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物酶和酶作用底物ELISA试剂盒有两种液态试剂A（过氧化氢），B（TMB），如出现颜色改变应废弃。酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物二、酶标记抗体或抗原酶+抗体

4、（抗原）抗体（抗原）化学反应结合或免疫反应结合酶抗体（抗原）特异性不变，酶活性不变。固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面三、固相载体要求结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品微颗粒（免疫磁珠）膜载体（微孔滤膜）固相载体第二节　酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定抗原抗体反应后需将结合的与游离的酶标记物分离后才能测定不需将结

5、合的与游离的酶标记物分离，即可测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶联免疫吸附试验ＥＬＩＳＡ（常用）斑点—ELISA斑点酶免疫渗滤实验免疫印迹法高灵敏度ELISABAS-ELISA派生出酶免疫技术的分类酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相测定技术异相测定技术液相法固相法—夹心法—捕获法竞争性ELISA非竞争性ELISA—间接法酶放大免疫测定技术克隆酶供体免疫分析平衡法；非平衡法第三节　酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)底物显色定性或定量的分析原理

6、包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必要试剂二、方法类型及反应原理1、双抗体夹心法应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定，如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。ELISA检测抗原的方法4、加酶底物1、包被：包被已知抗体洗涤去除未结合抗体2、加样：加待测标本（待测抗原）3、加酶标志物：酶标抗体洗涤去除未结合物洗涤去除未结合物，酶标抗体加终止液5、结果判定：肉眼观察—定性分析；酶标仪检测—定性或定量分析双位点一

7、步法？1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2、竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法洗涤洗涤竞争法

8、测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗