实验五 影响酶活力因素

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1、实验10影响酶活力的因素——正交实验法（碘量法测定酶活力）四个班，每班分16组两个同学一组目的要求：初步掌握正交实验设计法（简称正交法）的使用，运用正交法测定底物浓度、温度和pH这三种因素对酶活力的影响。实验原理：酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶的反应速度。这种多因素的实验可通过正交法即用—特制的表格——正交表来安排试验，计算和分析实验结果。这样就能通过少量实验取得较好的效果。实践证明正交法是一个多、好、快、省的方法，目前已广泛用于农业生产和科学实验中。本实验运用正交法测定酶浓度、温度、PH值这三个因素对酶活性的影响，并求得在什么样

2、的底物浓度、温度和pH值时酶的活性最大。酶活力用硫代硫酸钠滴定法测定。过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵做催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2+Na2S2O4→2NaI+Na2S4O6反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。实验器材：试管15毫升试管9*16=144支吸管1毫升2*16=3

3、2支吸管5毫升2*16=32支吸耳球16个漏斗1个研钵（或者搅碎机）1个（1台）恒温水浴锅3台铁架台16个蝴蝶夹16个酸碱两用滴定管16个100毫升的三角烧瓶3*16=48个烧杯500毫升18个（装好水放到恒温水浴锅里）实验所需药品：1.0.01mol/L的过氧化氢溶液每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升1.1毫升过氧化氢溶液，用蒸馏水定容至1000毫升。（用带盖白色试剂瓶分装10瓶。分装1000毫升即可，其余3000用白色大试剂瓶装好备用）2.1.8mol/L的硫酸溶液（每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升）共配4000毫升95毫升浓硫酸，用蒸馏水定容至1000毫

4、升。（用带塞白色试剂瓶分装10瓶。分装1000毫升即可，其余备用）3.10%钼酸铵溶液(每组需30滴，每班需16ⅹ30=480滴)共配500毫升20克钼酸铵，少量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至200毫升（用带胶头滴管的白色试剂瓶分装10瓶。）4.0.02mol/L硫代硫酸钠溶液（每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升，配置6000毫升）4.97克硫代硫酸钠溶解于少量蒸馏水，蒸馏水定容至1000毫升。（用带胶头滴管的白色150毫升试剂瓶分装10瓶，分装1000毫升即可，其余备用）5.1%的淀粉溶液（每组需50滴，每班共需16ⅹ50=800滴，每班需200毫升，实验临用前配置）2克淀粉

5、，加入50毫升开水完全溶解，后用蒸馏水定容至200毫升。（用带胶头滴管的白色试剂瓶分装6瓶）6.20%的碘化钾溶液（每组需12毫升，每班共需16ⅹ12=192毫升）共配1000毫升200克碘化钾溶解于少量蒸馏水中，蒸馏水定容至1000毫升。（用棕色容量瓶配，用带塞棕色50毫升试剂瓶分装，分装10瓶）7.巴比妥钠---盐酸缓冲液A液：0.04mol/L巴比妥钠盐8.25克蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至1000毫升B液：0.2mol/L16.5毫升浓盐酸加蒸馏水定容至1000毫升pH5巴比妥钠--盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液200毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）

6、pH7巴比妥钠---盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液178毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）pH9巴比妥钠---盐酸缓冲液：用洁净烧杯配制A液1000毫升+B液165毫升（用pH计测，用盐酸和氢氧化钠调pH）实验步骤：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片1.25克，剪碎置研钵中，加入约0.5克碳酸钙和10毫升水研磨成匀浆，用漏斗移入250毫升容量瓶中，研钵少量蒸馏水冲洗，洗液也移入瓶中，用蒸馏水定容至刻度。（由加班同学在每次课前准备，用带塞白色50毫升试剂瓶分装10瓶，每瓶大约分25毫升。标签名称：酶液）2.实验设计本实验取三个因素，酶浓度[E]、温度、pH值。每个因

7、素选三个水平（水平即允许因素允许变化范围内，要进行试验的“点”，见下表：表1正交试验设计表因素水平酶浓度/[E]ml温度/℃pH10.537521.550732.5609按一般方法,如对三个因素三个水平的各种搭配都要考虑,共需做33=27此实验，而用正交表只需做9次试验.选用L9表(L是正交表的代号),L右下角的数字表示试验次数)。列号表2L9表试验号1（酶浓度/[E]ml）2（温度/℃）3（pH）11(0.5)1（37℃）1（5）21(0.5