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1、槐米中芸香苷（芦丁）的提取与鉴定时间：2010-02-0612:57:37来源：作者： 分享： 收藏： 细胞实验分离培养骨髓间充质干细胞大鼠主动脉平滑肌细胞培养大鼠骨骼肌细胞培养蛋白实验TUNEL检测细胞凋亡染色质免疫沉淀技术(ChIP)凝胶迁移实验(EMSA)分子克隆实验原位杂交DNA甲基化检测高分辨熔解曲线(HRM)摘要： 芸香苷结构中含有酚羟基,具酸性,能溶于碱水,当加入酸溶液后,则芸香苷沉淀析出.芸香苷的精制是利用其可溶于热水,难溶于冷水的性质与杂质分离.【实验目的】1、学
2、会运用碱溶酸沉法,从槐米中提取、精制芦丁,并进行水解.2、学会用显色反应及纸色谱法检识黄酮类化合物.【实验原理】 采用碱溶酸沉法提取,其原理是芸香苷结构中含有酚羟基,具酸性,能溶于碱水,当加入酸溶液后,则芸香苷沉淀析出.芸香苷的精制是利用其可溶于热水,难溶于冷水的性质与杂质分离.【实验材料】 设备:电炉、托盘天平、500ml烧杯、量筒、玻璃棒、移液管、纱布、温度计、滴管、抽滤装置、研钵、250ml圆底烧瓶、冷凝管、水浴锅、pH试纸、新华色谱滤纸、紫外灯、展开筒、试管、试管架. 药品:槐米粗粉、浓盐酸、蒸
3、馏水、0.4%硼砂、石灰乳、2%硫酸、95%乙醇、氢氧化钡、葡萄糖标准品水溶液、鼠李糖标准品水溶液、正丁醇、醋酸、芦丁标准品、槲皮素标准品、氨水、三氯化铝、浓硫酸、α–萘酚、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、镁粉、苯胺-邻苯二甲酸、醋酸镁【实验步骤】1、芸香苷的提取: 称取槐米粗粉20g,置500ml烧杯中,加入0.4%硼砂沸水溶液200ml,在搅拌下加石灰乳,调至pH8～9,加热微沸20分钟(注意保持pH8～9),并随时补充蒸发掉的水分,趁热用四层纱布滤过.滤渣同样操作再提取一次,合并两次滤液.滤液在60℃～70℃
4、用浓盐酸调至pH5左右,静置过夜使沉淀完全,抽滤,沉淀用蒸馏水洗2～3次至中性,抽干,置空气中晾干,得芸香苷粗品.2、芸香苷的精制: 称一定重量的粗品,按约1∶200的比例悬浮于蒸馏水中,煮沸10分钟使其全部溶解,趁热抽滤,冷却滤液,静置析晶.抽滤,置空气中晾干或60℃～70℃干燥,得精制芸香苷,称重,计算得率.3、芸香苷的水解: 取芸香苷1g,研细后置于250ml圆底烧瓶中,加入2%硫酸溶液100ml,直火微沸回流约40分钟,至析出鲜黄色沉淀不再增加为止,放冷抽滤,滤液保留作糖检查,沉淀用少量水洗去酸,抽
5、干水分,晾干称重,得粗制槲皮素,然后用乙醇(95%乙醇约15ml)重结晶即得精制槲皮素.4、鉴定: (1)糖的纸色谱鉴定: 样品:取上述滤去槲皮素的水解母液20ml,搅拌加饱和的氢氧化钡水溶液中和至pH7,滤去沉淀,滤液浓缩至1～2ml得样品液 对照品:葡萄糖标准品水溶液、鼠李糖标准品水溶液 支持剂:新华色谱滤纸(中速15cm×7cm) 展开剂:正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)上层液 显色剂:苯胺-邻苯二甲酸试剂喷雾,105℃烘10分钟,显棕色或棕红色斑点 (2)芸香苷、槲皮素的纸色谱鉴定:
6、样品:1)自制芸香苷乙醇液 2)自制槲皮素乙醇液体 对照品:1)芸香苷标准品乙醇液 2)槲皮素标准品乙醇液展开剂:1)正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)上层液 2)15%醋酸水溶液 显色剂:1)先在可见光下观察斑点颜色,然后在紫外灯下观察斑点颜色 2)经氨气熏后再观察 3)喷三氯化铝试剂后再观察 (3)Molish反应: 取芸香苷少许置小试管中,加乙醇0.5ml,加10%α 萘酚溶液1ml振摇使溶解,沿管壁徐徐加入浓硫酸约
7、0.5ml,静置.观察两层溶液的界面变化,出现紫色环者为阳性.以同法试验槲皮素,比较二者的不同. (4)酸性实验: 取小试管四支为一组,共二组,第一组每管中加入芸香苷1mg,第二组每试管中加入槲皮素1mg,每组分别加稀氨水、5%碳酸氢钠溶液、5%碳酸钠溶液和1%氢氧化钠溶液各2ml,振摇后,观察各管溶解情况,溶解的溶液应呈黄色.再加盐酸数滴,黄色应褪去或变浅,并有沉淀或浑浊析出. (5)镁粉-盐酸反应: 取芸香苷1mg,加乙醇1～2ml在水浴上加热溶解,加镁粉约50mg,滴加几滴浓盐酸,溶液由黄色渐变红色者
8、,表示有黄酮类化合物.以同法试验槲皮素. (6)三氯化铝反应: 取芸香苷1mg,加甲醇1～2ml在水浴上加热溶解,加入1%三氯化铝甲醇溶液2～3滴,呈鲜黄色,以同法试验槲皮素. (7)醋酸镁反应: 取芸香苷1mg,加甲醇1～2ml水浴中加热溶解,加1%醋酸镁甲醇溶液2～3滴,呈黄色荧光反应.以同法试验槲皮素.【实验说明】1、硼砂的作用,芸香苷分子中因
