Illumina测序前文库制备.pdf

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1、测序前文库制备-Illumina测序平台报告人：刘竹琳Email:support@neb-china.comTel：010–82378266-2二代测序平台Roche454ABISolidIlluminaHiSeqXTen20052006200720102014IlluminaSolexaIlluminaHiSeq2000测序应用•基因组学全基因组Denovo测序全基因组重测序外显子&目标区域捕获测序•转录组学转录组测序数字基因表达谱测序SmallRNA测序长链非编码RNA测序（LncRNA-Seq）CircRNA测序

2、•表观组学甲基化测序ChIP测序测序流程NEBNextReagentsforIllumina原理GenomicDNADNA应用ChIPDNAIllumina原理Directional应用Non-RNADirectional原理SmallRNA应用DNALibraryPrepforIlluminaFragmentationEndRepairdATailingAdaptorLigationPCREnrichment末端补平磷酸化加A尾连接接头片段化PCR（T4、Klenow、（Klenow（T4DNA基因组DNA（Q5、dNTP）PN

3、K、dNTP）exo-、dNTP）Ligase）DNALibraryPrepforIllumina-FragmentationFragmentationEndRepairdATailingAdaptorLigationPCREnrichment末端补平磷酸化加A尾连接接头片段化PCR（T4、Klenow、（Klenow（T4DNA基因组DNA（Q5、dNTP）PNK、dNTP）exo-、dNTP）Ligase）WhatisDNAfragmentation？DNAfragmentationistheseparationorbreakin

4、gofDNAstrandsintopieces.MethodsofDNAFragmentationNebulization:Illumina(100-200bp)/Roche454(500-800bp)Sonication:ABISOLiD(100bp)Enzyme-based:NEBNEBNextTMdsDNAFragmentase简介由两种酶组成，一种切刻双链中的一条链，另一种在切刻的对侧切割能将dsDNA切割成100-800bp，片段大小取决于反应时间片段化的DNA末端是粘性末端，5’磷酸基，3’羟基DNA的量与酶的比例

5、是常数，反应时间长短决定片段大小DNA片段化的方法–酶学法NEBNextTMdsDNAFragmentase•组成：两种内切酶•创伤弧菌核酸酶突变蛋白质Vvnendonucleasemutant（Vibriovulnificusnucleasemutantprotein）•T7核酸内切酶突变蛋白质T7endonucleasemutant（T7endonucleasemutantprotein）NEBNextTMdsDNAFragmentase切割原理VvnendonucleasemutantT7endonucleasemutant53

6、dRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibo35•dsDNAFragmentase™generatesdsDNAbreaksinatime-dependentmanner•TheresultingDNAfragmentscontainshortoverhangs,5´-phosphates,and3´-hydroxylgroups.FragmentaseReactionProtocol1.建立反应体系，不要加入Frag

7、mentase2.放置冰上5分钟加入顺序：H2O、DNA、buffer、BSA3.加入Fragmentase基因组DNA4.37℃温育，温育WGADNA时间根据情况而定PCR产物（1-6kb）RT-PCR产物（1-6kb）5.终止反应：加入5ul0.5MEDTAGC-rich基因组DNA6.用于DNA末端修复、分离不同大小片段、分析AT-rich基因组DNAM0348S50次反应100ul￥1149.00M0348L250次反应500ul￥4569.00Fragmentase优势优势易缩小或放大体系，高通量易控制片段大小

8、价格便宜Figure3:RelativesizedistributionofE.coliDNA使用方便fragmentswithNEBNextdsDNAFragmentasevs.Nebulizationasseen