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1、山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位对D.freelethaneextractionfromcrudeandprocessedCornusOfficinalisonbonemarroiceinducedbyD-galactose.MethodsDNAdamageofbonemarroiceinducedbyD-galactoseRNAationrateofmodelgroupberofⅢandⅣDNAdamagecells.Thetailformationrateofdichloromethaneextrac
2、tiongroupsodelgroup(P＜0.05).p53mRNAexpressionofmodelgroupageofbonemarroiceinducedbyD-galactose.BothdichloromethaneextractionfromcrudeandprocessedCornusOfficinalisareprotective.p53mRNAexpressionup-regulatesinmodelgroup,ethaneextraction；D-galactose；bonemarr
3、oice山茱萸为山茱萸科落叶小乔木植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)的干燥成熟果肉,又名枣皮、山芋、药枣、肉枣(《本草纲目》)、实枣儿(《救荒本草》)等1-2,其味酸、涩,.freelega；琼脂糖,中国医药上海化学试剂公司；TBE,生工·生物工程(上海)有限公司；正常熔点琼脂糖(NMPA),华美生物工程公司产品；低熔点琼脂糖(LMPA),Sigma公司产品,进口分装；TritonX-100,Amresco公司产品,进口分装；溴化乙锭(EB),Sigma公司产品,进口
4、分装。1.2动物ICR级小鼠,(20±2)g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,生产许可证：SCXK(沪)2007-0005。2实验方法2.1供试药的制备山茱萸生品购自河南省西峡县,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸CornusofficinalisSied.etZucc.的干燥成熟果肉,其炮制品由南京中药饮片厂依据《中华人民共和国药典》(一部)2005年版方法炮制,即取净山茱萸肉,加酒拌匀,置容器内加热蒸至酒吸尽,取出,干燥。山茱萸总提二氯甲烷部位的制备：取山茱萸生品、制品各500g,用10倍量9
5、5%乙醇回流提取1.5h,抽滤,药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h,抽滤,药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5h,抽滤,合并滤液,60℃旋转蒸发浓缩至1000mL。用二氯甲烷(1∶1)萃取,直至下层近无色(5次),合并二氯甲烷萃取液,浓缩至干,得到总提二氯甲烷生制品部位。用植物油、吐温-80、蒸馏水按1∶1∶8比例配成200mL的乳剂(0.5g/mL)4。本实验选用剂量根据前期实验摸索,选用临床等效量的高剂量4。2.2D-半乳糖溶液的制备取D-半乳糖5g溶于100mL生理盐水中,制成5%D-半乳糖溶液
6、。2.3阳性药的制备阳性药选取维生素E,用植物油、吐温-80、蒸馏水按1∶1∶8比例配成200mL的乳剂(400mg/100mL)。2.4分组与给药取ICR级小鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。分为模型组(生理盐水)、生品组(生品二氯甲烷萃取部位)、制品组(制品二氯甲烷萃取部位)、阳性药组(维生素E)、正常组(生理盐水)。各组每日按0.2mL/10g剂量灌胃给药1次,模型组和给药组皮下注射5%D-半乳糖溶液1次,连续30d5。2.5动物取材给药结束后取血,并从取血后的小鼠股骨处取出骨髓,备用。
7、2.6单细胞电泳NMPA50μL铺第1层胶,压片；制备好的细胞混悬液5μL与45μLLMPA铺作第2层胶,压片；50μLLMPA铺第3层胶,压片；揭去盖玻片,倒入新鲜配制预冷的细胞裂解液,置4℃冰箱,避光裂解1h。把预冷的DNA解旋液倾入电泳槽中,避光解旋20min。调节电压为25V(定压),电流160mA,电泳20min。凝胶片用中和液中和漂洗3次,每次1min。EB染色。24h内在荧光显微镜下用515～560nm的激发光观察并测量彗星尾长。把细胞损伤分为不同的等级,正常：＜20μm；Ⅰ级损伤：20～4
8、0μm；Ⅱ级损伤：40～60μm；Ⅲ级损伤：60～80μm；Ⅳ级损伤：≥80μm。结果采用SPSS15.0统计软件进行数据分析。2.7骨髓总RNA的提取收获骨髓细胞,生理盐水冲3次,1000r/min离心10min,取沉淀,移入1.5mLEppendorf管中,加入1mLTRIZOL试剂,用加样器吹至液体澄清且无组织团块,加入0.2mL氯仿,颠倒混匀15s,置室温2～5min。4℃、12000r/min离心15min,转上层水
