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1、山茱萸提取部位对D王明艳，江励华，董菊，许冬青，杜逸芳，俞晓忆，杜伟锋，蔡宝昌【摘要】目的探讨山茱萸几种提取部位对D-半乳糖致衰模型小鼠骨髓细胞DNA的影响。方法取ICR小鼠.freelFructusCornionDNAofmarroice.MethodsThesubacuteagingmodelice,andtheDNAchangeetrydetection.ResultsD-galactosehadtheeffectonDNAofmarroiceandextractsfromFructusCorni,es
2、peciallytheextractofpetroleumshoage.ConclusionTheextractsfromFructusCornihaveeffectonDNAofmarroice.Keya公司产品，进口分装;TritonX-100，Amresco公司产品，进口分装;溴化乙锭(EB)，Sigma公司产品，进口分装;PI染料，PE公司提供。1.4仪器BX50/BX-FLA型荧光显微镜，日本OLYMPUS公司出品;DYCP-38A水平电泳槽，北京六一仪器厂产品;DYY-6B型稳压稳流电泳仪，北京六
3、一仪器厂产品;流式细胞仪，FACSCalibur,美国产品。2方法2.1山茱萸制品几种提取部位的制备山茱萸饮片由南京中药饮片厂按2005版《中国药典》1加工制得山茱萸酒蒸品。取一定量的山茱萸酒蒸品，用10倍量95%乙醇回流提取1.5h，趁热抽滤，药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h，趁热抽滤，药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5h，趁热抽滤，合并滤液，60℃旋转蒸发浓缩制成浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取，挥干溶剂即得相应的溶剂萃取物，其中石油醚、正丁醇溶剂萃取部位用吐温-80∶植物油∶水
4、=1∶1∶8配成乳剂在本实验中备用。取一定量的山茱萸酒蒸品粗粉(20目，去核)，加蒸馏水提取1.5h，抽滤，滤液加无水乙醇至醇浓度为80%(V∕V)，醇沉，过夜，抽滤，然后收集醇沉粗多糖部位，于50℃真空干燥至恒重，精密称定多糖的重量,用蒸馏水配成一定浓度的溶液备用。2.2亚急性衰老模型的制备取ICR纯种小鼠，每天颈背部皮下注射5%D-半乳糖溶液0.1ml/10g(即500mg/kg)造模，连续注射1个月，1个月后进行指标检测。2.3分组与给药ICR小鼠(18～22g)随机分为5组，分别为正常对照组，模型组，
5、用药组。均行灌胃给药,1次/d,连续30d，给药剂量根据前期实验结果选择、确定结果表1。表1实验分组情况2.4动物取材颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，用生理盐水冲出骨髓细胞，备用。2.5试剂配制2.5.1凝胶用琼脂糖的配制正常熔点琼脂糖(NMA)用PBS液配成浓度为0.75%溶液;低熔点琼脂糖(LMA)用PBS液配成浓度为0.6%溶液。室温储存备用。2.5.2细胞裂解液配制先配制贮备液(2.5mol/LNaCl,.freelmol/LNa2EDTA,10mmol/LTris-HCl,pH10.0),室温保存。应用液
6、在实验前新鲜配制,取上述贮备液89ml加入1%TritonX-100,1ml和10%DMSO,10ml定容至100ml置4℃冰箱中预冷备用。2.5.3DNA解旋液(即电泳液)的配制先配制贮备液:NaOH配成终浓度为10mol/L溶液(贮备溶A);Na2EDTA配成终浓度为200mmol/L溶液(贮备溶B);应用液临用前新鲜配制:取贮备溶A液30ml加贮备溶B液5.0ml再加双蒸水至1000ml,4℃冰箱放置备用。2.5.4中和液和染色液的配制取Tris用双蒸水成浓度为0.4mol/L中和液,用浓盐酸调pH至7
7、.5,室温保存。取溴化乙锭配成终浓度为200μg·ml-1染色储备液(×10),贮于棕色瓶内4℃保存。临用前倍稀释。2.6单细胞电泳2.6.1凝胶制片参照Singh等介绍的“三明治”铺胶法7有所改进8，9。采用磨沙载玻片,NMA(0.75%)50μl铺第1层胶;制备好的细胞混悬液5μl与45μlLMA(0.6%)迅速轻轻混匀后铺作第2层胶;最后再于第2层胶上铺1层50μlLMA(0.6%)的第3层胶;其中每层胶都需用盖玻片压片。2.6.2细胞溶解将铺好三层胶面的载玻片，揭去盖玻片,轻放到方形盒中，倒入新鲜配制
8、预冷的细胞裂解液，保证液体浸没玻片表面,放入4℃冰箱中，避光裂解1h。2.6.3DNA解旋、电泳取出玻片,放置在水平电泳槽中,倾入新配制预冷的DNA解旋液,使液面浸没所有玻片,避光解旋20min。DNA解旋结束后,室温下对电泳槽通电。调节电压为25V(定压),电流180mA,电泳20min。2.6.4中和、染色、镜检电泳结束后将凝胶片用中和液中和漂洗3次,每次1min。中和后的凝胶片,在胶体表面滴加
