B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究

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1、军医进修学院博士学位论文英文缩略词表军医进修学院博士学位论文军医进修学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新"的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谓}的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：枷影乞／指导教师签名：日期：夕膨

2、6、I-，秒日期：0c镌·j·fo军医进修学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)。日期：阳扩、f、．／o日期：文卯笤·r·(p军医进修学院博士学位论文第一部分B和C基因型重组全长乙型肝炎病毒的构建及其在Huh7细胞内的复制和表达—1上．—j一日O舌全世界乙型肝炎病毒(HBV)感染者超过3

3、．5亿人，严重者可发展为肝硬化、肝癌，每年大约有100万患者死于慢性乙型肝炎的并发症。由于HBV的宿主范围狭窄丽缺乏动物模型，当前体3'／'HBVDNA转染的细胞系是研究HBV生物学功能和药物筛选及耐药机制研究的主要手段，为研究HBVDNA的结构与功能、基因表达与调控，以及体外抗HBV药物的筛选等研究提供了一个有力的工具，大大促进了对HBV的研究；HBV是嗜肝病毒，根据HBV全基因组序列差异，差异在8％或以上命名为一个独立的基因型，据此HBV被分为A、B、C、D、E、F、G和H8个基因型[¨】；不同基因型的HBV有不同的地理分布特征15诺】

4、，A基因型主要分布在欧洲西北部、北美和非洲中部地区，B和C基因型主要在亚洲，D基因型主要在地中海、中东和印度，E基因型主要在非洲的撒哈拉地区，F基因型主要在美国，G基因型主要在美国和法国，在中美洲发现H基因型；目前研究发现不同基因型在HBeAgIII[清学转换的时间、发展成肝细胞癌和对干扰素的治疗反应等方面存在明显不同【9．惕】；不同基因型的HBV致病的严重程度也存在差异，在不同基因型的对比研究中发现：B基因型HBV感染发展成肝纤维化或肝细胞癌比C基因型慢【ll】；在日本研究发现，与C基因型相比D基因型HBV感染主要以慢性携带状态为主fl9

5、j；B和C基因型HBV前．C区和C区启动子突变的机率高pJ；在西方国家，A基因型HBV感染预后好于D基因型，D基因型病情偏重，肝细胞癌发生率高[20,21l；在干扰素的抗病毒治疗中发现，B基因型HBV对干扰素的敏感性好于c基因型15,16】。由于在我国人群感染的HBV是以B和C基因型为主，与其他基因型的HBV相比无论在病情的严重程度和对抗病毒治疗的反应上有明显不同；国外学者构建的各种9军医进修学院博士学位论文重组HBV都是从国外患者体内分离的病毒株构建的，直接拿来研究我国HBV感染的发病机制、病毒与机体的相互作用或新药开发及耐药等方面是不合

6、适的，为此，我们拟构建针对以我国人群感染为主的B、C基因型的重组HBV表达载体，并在体外肝源细胞系内验证其复制表达水平，以评估其用于研究的前景。材料与方法I．标本来源：北京地坛医院门诊的两例慢性乙型肝炎患者，诊断符合慢性乙型肝炎诊断标准。患者血清HBeAg阳性，HBVDNA载量达106拷贝／mL，血清转氨酶水平轻度升高。均排除甲型、丙型、丁型、戊型和庚型等其他病毒感染，以及酒精性肝病、药物性肝病及肝癌。2．主要仪器和试剂：觑棚III、SacI购于大连Takara公司；T4DNA连接酶、去磷酸化酶、SapI购于美国NEB(NewEngland

7、Biolabs)公司；BDAdvantageM2PCRKits购于Clontech公司；DMEM培养基，胎牛血清，脂质体lipofectamine2000均购于美国Invitrogen公司；ReadyPCR刚血清病毒DNA纯化系统购于华美生物工程公司；HBsAg和HBeAgELISA检测试剂盒购于北京科卫临床诊断试剂有限公司；DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII试剂盒购于罗氏公司；乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒购于上海科华生物工程股份有限公司。3．质粒和细菌：质粒pHYl06

8、由武汉同济医科大学病毒研究所的卢银平博士赠送，该质粒为真核表达质粒，上游含有CMV启动子序列和小部分HBV序列，下游含部分HBV序列，二段序列之间含有SapI酶切位点，是HBV全