重组腺相关病毒介导的rna干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

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分类号：单位代码：10092密级：学号：20101053重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎单病毒复制和表达的影响河北北方学院基础医学院专业：病理学与病理生理学研究生姓名：付冰峰导师姓名及职称：宁守斌教授、张晓云教授研究起止日期：提交日期：2012．4—2013．42013．5 河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河：it：It方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：．、“咱叫、、，研究生签钏寸“<啐年月日研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师虢咱鸣鼍．研究生签名：1寸hj<霹1年月日 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响前—言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯66日IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35综述RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯．．39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49 目录 中文摘要重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响摘要乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HSV)感染是一个非常严重的全球性的公共卫生问题，全世界约3．5亿人为慢性HBV感染者，每年全球大约有100万人死于与HBV感染相关的疾病，包括肝炎(Hepatitis)、肝硬化(Cirrhosis)、肝衰竭(Hepaticfailure)和肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。目前对HBV感染的主要治疗手段包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等，但是这些药物只能在少数慢性感染患者中能产生长期应答，并不能彻底清除乙肝病毒，并且也存在着治疗后复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题，因此，必须寻找更有效的治疗手段。RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)R0将与其目的基因同源的小分子双链(dsRNA)导入细胞内，导致目的mRNA降解，从而阻断真核细胞中相应基因产物的表达，它具有抑制效率高、特异性强、细胞较容易摄取等优点，成为-,0e新的分子生物学技术。但同时也存在作用时间短暂等不足。为解决这一问题，本实验采用腺相关病毒作为载体，利用它具有高稳定性、高靶向性、低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛、可长期表达等优点，作为抗HBV的shRNA表达框的载体，转染含HBV病毒全基因组的HepG2．2．15细胞，观察对HBV复制和表达的抑制作用，尝试解决RNAi技术抗HBV作用时问短暂的问题。本研究将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(Adeno—associatedvirus，AAV)的两个ITR(Invertedterminalrepeat，ITR)之间，之后接有HBV的基本核心启动子(BacicCorepromoter，BCPl及其驱动AAV的Rep基因，由此构成rAAV，作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体，转染HepG2．2．15细胞(乙肝病毒基因插入肝细胞性肝癌细胞中)，测定转染后细胞上清液中第1天、第2天、第3天及 中文摘要第10天HBsAg、HBeAg表达及HBVDNA拷贝数，并对细胞基因组AAVSl区域进行测序。经检测表明，成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322—324、PLRBR522—324、PLRBR322—2424、PLRBR522—2424。体外质粒转染细胞实验显示四个载体对HBsAg、HBeAg表达及HBVDNA复制都有抑制效应，且前两者对HBsAg更高、后两者对HBeAg更高，第三个对HBVDNA拷贝数更高。转染后第3天后抑制效应最明显，第10天抑制率仍较高。针对细胞基因组AAVSl区域测序结果显示，目的序列定点整合于该区域。以上结果表明，利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体，借助Rep蛋白介导的定点整合作用，为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索。关键词：RNA干扰；短发夹RNA；rAAV；HepG2．2．15细胞：定点整合 英文摘要EFFECTSOFRNAINTERFERENCEMEDIATEDBYRECOMBINANTADENO．ASSOCIATEDVIRUSONHBVREPLICATIONANDEXPRESSIONABSTRACTHepjatitisBviirus{(《hlepatitisB：：virlus,H⋯BV)infectionisaseriousglobalpub|：lichealth。pro。；、b⋯lem。。．A。b。。outi3．5milliontSpopulatitrou蠢ble．攀dj：|iw鬻itlh鬻ch。iro藕nic攀强羹V蓉iin。fie攀i鬻≥i辫and霪ab囊outonemillionoplfroi!{|mi。：H童B}V鬻≥。in蓬麟麟瀚幽麟瀵鬻j满鬻羧i鬟瀵≥。In～clud。ingh、epatitisI，：cirrhosis。liver；f。ai麟蘸an。d。}麟蓊藕。c。el薰lu；la。rc。a。rcin。oma(HCCurrentlythetriei。a蠢tm舀e辫n。t戮睡鬃一iinjf二e麓citiio蘸n。,iinic童lu：d9esiintier‘fer。on,nucleosideandnucleotide鞘alogs；howeveir,⋯。th。e二1；1se：j“。如’。gsc。。arl‘?produceonlyasmallnumber0fchro”nicNly攀、¨『in蠢f，e；ct：。e颤dli熬遴termrespo—ns—e,d⋯oesnotco⋯mplet—ely。1clearthehepatitisBjv赫s；besides,thereareproblemsSUchias1。+am@rateof一一|：一砖ec、urrienc“e毫a；fte。囊rtrieii‘ii．1dru⋯‘lg”sideeffectsandhighcostthereforewe鳓Stfind。amore—e蟹赣鬻确童骥m鏖e!；|；|al国n。s⋯．RNAin。；terf。一erence，■40wnl。asthesjm撕molecuedouble-stranded(dsRNA)n分，,homologouswiththetargetgeisintroducedintocellsleading、，一，一topurp—ose⋯7、。mRNAdegrad—atio。n,一theirebyblockingtheexpressionofthecorrespondinggeneproducts啦eukaryoticcells．Ithasthecharacteristics：includinghighilnhibitionefficiency,specl’ficity,andeasiercellularuptakeetc，becomingan。ewmolecularbiologytechnique．Butatthesametime，italsohasthedefectsofshortduration．TosolvethiSproblem，ThiSexperimentusedadeno—associatedvirusasavector,withtheadvantagesofhighstability、hightargetinglowpathogenicity、lowimmunogenicity,widehostrange、long-termexpression，etc，asthevectorofshRNAanti-HBVexpressionbox，thentransfectedinto。HepG2．2．15cells一(、HCCcellS。insertedintoHBVgene)，observingtheeffectsOilHBVreplicationandexpression，tryingtOsolvetheproblemthat3 英文摘要RNAitechnologyanti—HBVactiontimeisshort．Theexpressionboxofhu6-shRNAwasplacedbetweentWOITRsofA鳃thenConnectedwithbasiccorepromoter(BCP)ofHBVandBCPdrivingRepGeneof枷andthusconstitutedrAAV．AsthevectorofshRNAanti-HBVexpressionbox,therAAVwastransfectedintoHepG221篱酝ells(HCCCellSinsertedintoHBVgene)．TheexpressionSofHBsAg攀an自d。HBeAg。andreplicationsofHBV-DNAtheculturedsupem“a。teI；rwieredetect稽edion麟1⋯甑2nd3rdand1dayaftertransfectionandthecellgenomesintheAAVS1regionweresequencedonthe3rdday勰萄醴||藿商蘸＆魄6※誉叠诗testsh6Wedthatthe。targetsequencedvectorsOfPL髓、R3—2”2-324,⋯PLRBR522-324，|『]PLRBR322-2424andPLRBR522-2424"，iweresuccess缸llyconstructe山Theexperimentsi如ithplasmidtransfectedcellsl'inj。vitroshowthat誊allthefourv：：ect。orshaveinhibitingefiectsonex—pression滋sof溯“sAlg；an}d—HBe；A爵andonHBV-DNAswiththe麓黛醚缫醚namely,PLRBR322-324andPLRBR522—324，havingmore蜒晦每缫趣l羹进删itory：effgectonth。eHBsAgexpressio：)；nandthelatter‘twoon髓”e。Aj。ge。xp—re。ssion；and粪thei矗rd?onHB妒V-DjNAreplicationTheinhibitory_；；ieffei，ctsof“皿。sAg。；薯HB。eAg舀xpressionan，dHBV-DNAreplicationwerethemost04bvi两◇砸the3rddayaftertransfection，andtheinhibitionrateremaiined重highonthe1Otllday．TheresultofsequencingcellgenomeintheAAVS1釜蟛onshowedthatthesite-directedintegrationofthetargetseque、1ncewaslocatedinthisregion．TheSeaboveresultsindicatethattherAAVconstructedbyseveralelementsofAAVandHBV,servingshRNAexpressingboxofanti—HBVasthevectortogetherwiththehelpofsite—directedintegrationmediatedbyRepprotein，。isagoodexplorationtOsolvetheproblemofRNAishort—termeffectagainstHBV．Keywords：RNAinterference；smallhairpinRNA；recombinantadeno—associatedvirus；HepG2．2．15cells；site—directedintegration4 英文缩写5 研究论文重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响前言根据世界卫生组织(WHO)统计，全世界大约有20亿以上人群感染了乙型肝炎病毒(HBV)，其中大约3．6亿人为慢性感染者，占全球人口的5％以上，其中亚洲占2／3，每年大约100万人死于HBV感染，并有超过400万的新发急性临床感染病例【11。我国每年报告的乙型肝炎新发病例数为50万左右，约占全国甲、乙类传染病报告发病总人数的1／4。根据调查结果显示，全国目前有慢性病毒性肝炎患者约2000万人，每年死于与乙型肝炎相关的疾病约28万人，其中50％左右为原发性肝细胞癌。在我国，每年用于肝炎和肝病的医疗、保健费用高达1000多亿元【2】。在美国HBV感染相关住院总费用达到每年13亿美元【31。因此，乙肝不仅在我国，而且在全世界都是一个严重的公共卫生问题，同时也是值得强烈关注的社会问题。慢性乙型肝炎的发生、发展与病毒的持续感染以及机体的免疫功能障碍密切相关【4】，主要治疗手段包括抗病毒、免疫调节、抗炎和抗氧化、抗纤维化及对症等治疗，其中抗病毒治疗是关键，持续有效的抑制病毒能够延缓甚至阻滞肝病进程，改善慢性HBV感染者的生活质量151。但是，抗HBV治疗，阻断肝细胞内HBV的复制和表达，仍是目前难题之一。核苷(酸)类似物和cL一干扰素or(interferon—Q，IFN—a)是目前全球公认的有效的抗HBV药物[6】，但是，这两类药物并不能彻底地清除HBV,疗效有限。因此，寻找一种全新的治疗HBV感染的方法势在必行。RNAi技术是指，利用同源双链小型干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)诱导特异性基因表达抑制的方法，是20世纪90年代末发现的一种真核生物细胞在转录后发生基因沉默的分子机制pJ，RNAi的发现有望弥补现有的治疗HBV药物的不足，已成为病毒学家们最寄予厚望的全新抗病毒技术，并用于抗HIVl8—21、HBV[13】、HCV[14-16]、FMDV 研究论文等多种病毒的研究。在目前所建立的诸多RNAi研究方法中，用载体表达短发夹RNA(smallhairpinRNA，shRNA)的方法倍受人们的关注。因此，RNAi技术，也为防治乙型肝炎病毒的感染提出了新的治疗思路。RNAi作为一种新的技术，实际作用过程中有些问题亟待解决，包括siRNA在体内稳定性差，容易被体内的细胞RNA酶降解；RNAi抗HBV作用时间短暂等【17】。很多学者为此进行了大量的研究，直到最近几年病毒载体的大量应用，为解决RNAi抗HBV作用时间短暂提供了新的方法。目前常用的病毒载体主要有逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)及腺相关病毒(adeno．associatedvires，AAV)。逆转录病毒及腺病毒等载体由于免疫原性高、随机整合有致癌危险、不能长期表达等缺点逐渐被弃用，而腺相关病毒则以其独有的优势，在近些年的研究中取得了长足的进步[18-19】。本研究将hu6一shRNA表达框置于AAV两个ITR之间，之后接BCP和Rep基因，构成rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体，利用AAV能使插入的siRNA表达时间延长，可稳定发挥干扰作用等优点，为解决RNAi作用时间短暂提供新的思路。材料与方法1材料1．1质粒、细胞株：质粒载体PGe．522、PGe一322、PLRBR(含卡那抗性)由北京军区总医院肝病治疗中心李绍祥教授惠赠。HepG2．2．15细胞由解放军302医院曲建慧副教授惠赠。1．2主要试剂及其配制：引物由北京科学技术研究院理化分析测试中心合成质粒小提试剂盒购于美国Promega公司胶回收试剂盒购于美国Promega公司限制性内切酶(BamHI、XbaI、XhoI)购于Takara生物技术公司T4连接酶、TaqDNA聚合酶购于Takara生物技术公司DH5Q感受态细胞购于Tigen公司 研究论文琼脂糖购于北京恒奥生物公司LB液体培养基(1％蛋白胨、0．5％酵母粉、1％NaCl、pH7．O)LB固体培养基(1％蛋白胨、O．5％酵母粉、1％NaCl、2％琼脂、pH7．0)DMEM培养液购于美国Gibco公司，4℃保存胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司转染试剂lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司质粒中提试剂盒购于康为世纪生物公司HBsAg和HBeAgELISA试剂盒购于上海科华公司，Real—TimePCR试剂盒均购于Takara生物技术公司DMSO购于Sigma公司磷酸盐缓冲液(PBS)：Na2HP041．429、KH2P040．279、NaCl89和KCl0．29，溶于800ml双蒸水中，用HCl调节溶液的pH值至7．4，最后加双蒸水定容至1L，分装，15磅120。C高压灭菌20min，4℃保存。细胞冻存液：配置比例为10％RPMI．1640：DMSO=10：1EDTA一胰蛋白酶：购于美国Sigma公司，EDTANa20．29，Trypsin：2．59用O．Olmol／LPBS(pH7．4)配制成0．25％，抽滤除菌，4℃避光保存1．3主要实验仪器及器材：PCR扩增仪美国伯乐公司凝胶成像仪美国伯乐公司核酸电泳仪美国Bio．Rad公司DYY-6B型稳流稳压仪北京六一仪器厂恒温水浴箱Amershampharmaciabiotech公司恒温振荡培养箱伊孚森生物技术公司离心机德国Sigma公司移液器德国EppendorfC02培养箱美国Nuaire公司YG一1450超净工作台苏州苏净集团24、12孔细胞培养板美国COSTAR公司光学显微镜日本Olympus公司电子天平美国OPTAST公司8 研究论文细胞培养瓶美国COSTAR公司AXSYM全自动酶标检测仪日本Abbott公司ABl7300realtimePCR扩增仪美国ABI公司高速离心机日本三洋公司2实验方法2．1目的片段的选择HBVE区GCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAA2424．2452HBVS区AACCTCCAATCACTCACCACCCTCTTGTC324．3522．2引物的合成船VE区正义链，5．GATCCCGGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAAGA，AGCTTGTTTACTGTTCCTGAACTGGAGCCACCAGCTTTTTT-3反义链，5．CTAGAAAAAAGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAA，CAAGCTTCTTTACTGTTCCTGAACTGGAGCCACCAGCCGG一3册VS区正义链5一GATCCCGAACCTCCAATCACTCACCACCCTCTTGTCGAAGCTT，GGACAAGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTTTTTTT一3反义链5一CTAGAAAAAAAACCTCCAATCACTCACCACCCTCTTGTCCAAGCTTCGACAAGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTCGG一32．3引物的退火用双蒸水调整引物工作浓度为1009mol／L，随后进行退火。退火体系如下：体系正反义引物945u1各5ul 研究论文双蒸水35ul退火条件如下：95℃5rain95℃以O．1℃／s降温至85℃85℃30s85℃以O．1℃／s降温至64。C4℃002．4对退火产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1)将O．759琼脂糖溶于50mlTAE溶液，放置于微波炉中加热至沸腾，摇晃使之充分溶解。(2)将溶液放置至60℃左右时，加入2ulEB溶液，充分混匀，倒入预先准备好的模具中。(3)放置至室温后放入电泳槽中，取5ul退火产物加溴苄兰(2x)5ul混匀后点胶，另点50bpMark溶液5ul。(4)接通电源，设置电流160mA、电压150v、30分钟。(5)将琼脂糖凝胶取出放入凝胶成像仪中照相(Fig1．1)2．5质粒转化(1)从一70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，冰上解冻。(2)加入质粒载体PGe一522、PGe．322、PLRBR，轻轻摇匀，冰上放置30min。(3)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。(4)向管中加入lmlLB液体培养基(不含抗性，已先放入37℃、150rmp摇床中)，混匀后37。C缓摇孵育1h，使细菌恢复正常生长状态。(5)1小时后将上述菌液摇匀后取1009l涂布于含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37。C培养16—24h。2．6重组质粒的提取待质粒转化后，挑取不同克隆菌落放入准备好的已经加入lmlLB液体培养基(已加入卡那霉素)的离心管中，放入37。C培养箱中振荡培养12—16h。然后进行质粒提取，步骤如下(按说明书操作)： 研究论文(1)用离心管收集菌液，12000rpm离心lmin，弃上清。(2)加入250pl溶液I／RNaseA混合液，剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。(3)加入250“1溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。(4)加入350“l溶液III后立即轻柔地反复颠倒混匀5．6次。此时出现白色絮状沉淀。(5)室温12000rpm离心10min，收集上清，将上清液置于DNA纯化柱中，静置1-2min。(6)12000rpm离心1min，弃去滤液，加入500“1溶液PB，12000rpm离心lmin，弃去滤液。(7)加入500l-tl溶液W，12000rpm离心lmin，弃去滤液。(8)加入500卜tl溶液W，12000rpm离心lmin，弃去滤液。(9)12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。(10)将DNA纯化柱放置于新的离心管中，向纯化柱中央处，悬空滴加50—100“溶液Eluent，室温放置2min。12000rpm离心lmin。滤液即是提取的质粒，．20℃保存。2．7退火产物与PGe载体的重组(1)用限制性内切酶BamHI和XbaI对载体PGe．322和PGe-522进行酶切，酶切体系如下：体系’30ul载体8ulBamHIlulXbaIlul10水K1．5ul双蒸水18．5ul酶切条件：37。C水浴过夜(2)对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(Fig1—2)。(3)在荧光灯下将琼脂糖凝胶电泳后的目的片段切下，放入离心管中，加400ul溶液DD。 研究论文(4)56℃水浴放置lO分钟(或至胶溶解)，每2—3分钟涡旋震荡一次，加速溶解。(5)将上一步溶液加入吸附柱EC中(EC柱放入收集管中)，室温放置1分钟，12000rmp离心60秒，倒掉收集管中废液。(6)加入500ul漂洗液WB，12000rmp离心60秒弃废液。(7)加入500ul漂洗液WB，12000rmp离心60秒弃废液。(8)将吸附柱EC放回空收集管中，12000rmp离心2分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇下游反应。(9)去除EC，放入一个干净的离心管中，在吸附柱膜中央加30ul去离子水(65。C一70。C水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12000rmp离心60秒，滤液即是回收的目的片段。(10)连接引物退火产物和载体酶切产物，分别命名为：322．324、522—324、322—2424、522．2424。连接体系如下：体系10ul退火产物3．5uI载体O．5ul2*buffer5ulT4酶lul连接条件：16。C水浴过夜(11)转化上一步的连接产物，再放入固体基中培养，挑单克隆菌落扩增，然后进行质粒提取。2．8目的片段和PLRBR穿梭质粒重组(1)用限制性内切酶XhoI和XbaI对表达载体重组质粒322—324、522—324、322—2424、522—2424和穿梭质粒PLRBR进行酶切，酶切体系如下：体系30ulDNA8ulXhoI1ulXbaIlul10木K3ul 研究论文双蒸水17ul酶切条件：37。C水浴过夜(2)对表达载体重组质粒和穿梭质粒酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(Fig1—3、Figl一4)并回收(3)连接表达载体重组质粒酶切产物和穿梭质粒酶切产物，分别命名为：322—324．PL、522—324一PL、322—2424一PL、522—2424．PL。连接体系如下：体系10ul重组质粒酶切产物3．5ul表达载体0．5ul2*buffer5ulT4酶lul连接条件：16℃水浴过夜(4)转化上一步的连接产物，并放入固体培养基中培养，从每个转化的平板上随机挑取3个单菌落进行过夜摇菌扩增，提取质粒DNA，并从中随机选取322．324．PL和522．2424一PL进行双酶切鉴定，其电泳结果与实验预计的结果完全相符(Fig1-5)。酶切体系如下：体系10ulDNA5ulXbaIlulXhoI1u1l0术K1u1双蒸水2ul连接条件：37。C水浴4小时2．9细胞复苏(1)准备好37℃温水备用。(2)将细胞冻存管从液氮中取出后立即放置于准备好的37。C温水中不断搅动。促使冻存物在1rain内融化。(3)将细胞悬液移至离心管中。 研究论文(4)600rpm离心10min，丢弃上清液。(5)将10ml培养液加入离心管中，将沉淀吹打均匀，再600rpm离心10min，丢弃上清液。(6)加入6ml培养基，在离心管中将细胞吹打均匀后转移至培养瓶中，放于37℃培养箱中培养，第二天观察其生长情况。2．10细胞培养细胞复苏后生长于DMEM培养基中(含10％胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、100U／ml青霉素及100J-tg／ml链霉素)，并在37。C、5％C02孵箱中进行培养，2—3天更换培养液。2．11细胞换液复苏后的第二天为了不让残存的DMSO抑制细胞生长，需要给细胞换液。以后视细胞的营养需求或者当培养基颜色变黄时，需要及时换液。超净台内操作，将全部原液吸出丢弃后，加入等量的混合培养基，操作时动作轻柔细致。2．12细胞的消化传代当细胞培养至大约铺满80％瓶底时，按1：2传代。于超净台内操作，弃掉原液后，用PBS冲洗两遍。加入0．25％胰酶300¨1，放入培养箱中放置lmin，直至有多数细胞从不规则形态变成圆形时，吸出胰酶，丢弃，然后再加入2ml混合培养基，轻吹细胞使之分散均匀，当大多数细胞游离成单个状态时，再加入10ml混合培养基，将细胞吹打均匀，分瓶，拧上瓶盖，瓶口略松，放置37。C、5％C02细胞培养箱中培养。2．13细胞的冻存冻存早期传代的细胞。超净台内操作，选用处于生长对数期的细胞，将培养基丢弃后，PBS冲洗两遍。加入0．25％胰酶300ra，培养箱内放置lmin，直至有多数细胞从不规则形态变成圆形时，吸弃胰酶，加入lml混合培养基，将细胞吹打均匀，800rpm离心5min后，弃上清，加入1．8ml含30％胎牛血清的混合培养基重悬细胞，再转移至冻存管中，补加DMSO至2ml，旋紧管口，做好标记，置4。Clh，一20。C3h，．80℃过夜，后放入液氮罐中保存。2．14细胞的计数 研究论文用酒精清洁计数板以及专用盖玻片，然后轻擦拭干。用胰酶分散单层贴壁细胞，行成单个细胞悬液，细胞密度需大于104／ml，若细胞数较少，应将悬液离心1000rpmx2min，重悬于少量培养液中。用吸管吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧滴加微量，在显微镜下，用10x物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，将计数结果代入下列公式，可计算出细胞密度。细胞数／毫升原液=(4大格细胞数之矛I：114)x1042．15质粒中提将第一部分实验合成的四个质粒(322．324．PLRBR、522—324．PLRBR、322．2424．PLRBR、522．2424．PLRBR)转化，LB固体培养基培养、挑菌、液体培养基中扩增，质行粒中提，具体操作过程如下(按试剂盒说明操作)：(1)取5．15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心1分钟，尽量吸弃上清液。(2)向留有菌体沉淀的离心管eODl]入5009lBufferP1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。(3)向离心管e?3JI],N．5009lBufferP2，温和地上下颠倒混匀6—8次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。(4)向离心管中加入7009lBufferN3，立即温和地上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀。(5)12000rpm离心10分钟，吸取上清，加入到已装入CollectionTube的SpinColumnCL中，注意不要吸出沉淀。(6)室温放置1—2分钟，使质粒DNA与吸附柱充分结合。12000rpm离心1分钟，倒掉CollectionTube中的废液，将SpinColumnCL放回CollectionTube中。(7)向SpinColumnCL加入500}tlBufferPB，12，000rpm，离心1分钟，倒掉CollectionTube中的废液，将SpinColumnCL重新放回CollectionTube中。(8)l甸SpinColumnCLdOJJH／x．7009lBufferPW(请先检查是否已 研究论文加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉CollectionTube中的废液，将SpinColumnCL重新放回收CollectionTube中。(9)向SpinColumnCL中加入500plBufferPW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉CollectionTube中的废液，将SpinColumnCL重新放回收CollectionTube中。(10)12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将SpinColumnCL置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的BufferPW。(11)将SpinColumnCL置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100．3009lBufferEB，室温放置2．5分钟，12000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。一20。C保存质粒。2．16细胞的转染(1)转染前用含0．25％胰酶．0．02％乙二胺四乙酸(EDTA)消化后吹打成单细胞悬液，细胞计数后接种于12孔培养板中，放于孵箱中进行培养。(2)约24小时后观察细胞生长铺满培养板孔底面积约70％时用于转染。(3)转染前更换无血清培养基，质粒与lipofectamine2000脂质体按lgg：39l共转染，室温放置20分钟后加入每孔中，在孵箱中培养6小时候换DMEM中(含10％胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺、100U／ml青霉素及100pg／ml链霉素)，并在37。C、5％二氧化碳孵箱中进行培养。(4)设空白对照组及转入空质粒的阴性对照组，每组设2个复孔。2．17ELISA法检测HepG2．2．15细胞上清中的HBsAg和HBeAg含量(按试剂盒说明操作)(1、)分别收集转染后第1天、第2天、第3天和第lO天各组细胞上清液，800rpm离心5min，取上清，弃沉淀。(2)按上海科华HBsAg试剂盒说明书操作：a加样：分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。然后在标准品孔中加入标准品509l，在样本反应孔中先加入待测样品109l，再加入样品稀释液409l，盖上封板膜，轻轻振荡均匀，37。C孵育45min。b配液：将20倍浓缩洗涤液用双蒸水20倍稀释后备用。 研究论文C洗涤：小心揭掉封板膜，净弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此过程重复4次，拍干。d加生物素标记的抗．IgG抗体：每个孔加入此抗体50}_tl(空白孔除外)，37℃孵育30min。e洗涤：操作同C。f显色：每孔先加入显色剂A50}-tl，再加入显色剂B509l，轻轻振荡均匀，37℃避光显色15min。。g终止：每孔加终止液50／21，终止反应。h测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔吸光度(OD值)，结果用S／N值(实验孔吸光度值／阴性对照孔吸光度值)表示。(3)检测HBeAg方法同(2)o2．18RealtimePCR检测上清液中的HBV-DNA含量(按试剂盒说明操作)(1)标本处理a分别取100lal转染第1天、第2天、第3天和第10天的上清液，加入等量DNA提取液体，剧烈振荡混匀，1200rpm离心10min，净去上清。往沉淀中加入20la1DNA提取液，剧烈振荡混匀，瞬时离心数秒。置于100℃恒温10min，1200rpm离心5min，备用。．b邶V临界阳性质控品、阳性定量质控品及阴性质控品处理：分别8000rpm离心10s，分别吸取50ul至离心管中，各再加入50ulDNA提取液充分混匀，100。C恒温处理10min，1200rpm离心5min，备用。CHBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心10s，备用。(2)PCR扩增a按HBV-PCR反应液40ul／份+Taq酶3ul／份的标准将PCR反应液和Taq酶充分混匀，然后分装至离心管中，备用。b将处理后的待测样品及DNA提取液2ul加入准备好反应液的离心管中，8000rpm离心10s。C用PCR仪检测，设置循环条件为：93℃2min，93℃45s，55℃60s，10个循环，93℃30s，55℃45s，35个循环。2．19细胞总DNA的提取 研究论文(1)收集处理转染后第3天的细胞上清，备用。然后用胰酶消化细胞，收集到离心管中，13000rpm离。t二,10s，丢弃上清，留下细胞团和大约10．209l残留的液体。(2)力H),,．2009l缓冲液TB重悬洗涤细胞，13000rpm离一l二,10s，丢弃上清后再加入200山缓冲液TB重悬细胞。(3)将2009l结合液CBD口X细胞悬液后，立即剧烈颠倒混匀，再JJH)＼．201．tl蛋白酶K(20mg／m1)溶液，混匀，在准备好的70。C恒温箱中放置10min。(4)待混合物冷却后jJN,X．1009l异丙醇，颠倒轻摇混匀，此时会出现白色絮状沉淀。(5)将溶液和沉淀都转移至己放入收集管的吸附柱中，10000rpm离4∑30s，丢弃收集管中的液体。(6)将500I．tl抑制物去除液IR加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液。(7)将7009l漂洗液WBDU／X．吸附柱中，12000rpm离一t],30s，弃掉废液。(8)将500111漂洗液WB加入吸附柱中，12000rpm离一t730s，弃掉废液。(9)将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离一l二,2min，尽量除去漂洗液。(10)将吸附柱放入一个干净离心管中，在吸附膜的中间部位加100IA洗脱缓冲液EB，室温放置5min，12000rpm离心lmin。将得到的溶液重新加入离。15,吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心lmin。(11)以DNA为模板引物15．AGGAACCCCTAGTGATGGAGT-3引物25．TCAGAGGACATCACGTG一3。行PCR，PCR产物送生物公司测序。3统计方法统计学分析采用SPSSl7．0数据包进行统计分析，计量资料采用 研究论文mean+SD表示，组间比较采用单因素方差分析，多个均数之问两两比较采用LSD法，以P<0．05认为有统计学意义。结果体外质粒转染细胞实验显示四个载体(322．324一PLRBR、522—324一PLRBR、322．2424一PLRBR、522．2424．PLRBR)对HBsAg、HBeAg表达及HBV-DNA拷贝都有抑制效应，且前两者对HBsAg更高、后两者对HBeAg更高，第三个对HBVDNA拷贝数高。转染后第3天后抑制效应最明显，第10天抑制率仍较高(Figl一6．一Figl一1l，Tab2—1—_Tab2．3)。针对细胞基因组AAVSl区域测序结果显示，目的序列定点整合于该区域。(Figl一12邓i91—15)19 研究论文附图Fig1-1PrimerannealingproductagarosegelelectrophoresisFig1-2Expressionvectorendonucleasereactionproductagarosegelelectrophoresis20 研究论文Fig1-3ExpressionvectorrecombinantplasmidendonucleasereactionresultsFig1-4Shuttleplasmidendonucleasereactionresults21 研究论文Fig1-5Recombinantshuttleplasmidendonucleasereactionidentificationresults35厂一30÷o量25}20o15}《盏10}、LTime——322．324．PL522．324．PL322．2424．PLj——522．2424．PL空白对照组；．⋯一阴性对照组Fig1-6HBeAgexpressionchangecurvePLRBR322．2424，PLRBR522—2424inhibitedHBeAgeffectisobvious，WhichPLRBR322—2424onthe3rddayuptomaximuminhibitionefficiencywas67．1％，onthelOthdayinhibitionrateisstillhigher，reaching51．3％ 研究论文30252015105⋯322324PL522．324．PL322．．2424．．PL⋯5222424PL一～空白对照组——阴性对昭钼Fig1-7HBsAgexpressionchangecurvePLRBR322-324、PLRBR522—324inhibitedHBsAgeffectisobvious，WhichPLRBR322—324onthe3rddayuptomaximuminhibitionefficiencywas68．6％，onthelOthdayinhibitionrateisstillhigher，reaching56．0％)厂o专4IoA壶3}《蕾2『>∞1L墨OL———————————上———————————J————————————L———————一1234TimeFig1-8HBVDNAreplicationchangecurvePLRBR322-2424inhibitedHBV-DNAeffectismostobvious，onthe3rddayuptomaximuminhibitionefficiencyWas57．0％，onthelOthdayinhibitionrateisstillhigher．reaching41．4％一。一∞∞QJd×∞o《∞∞z0 研究论文35—30o譬25o量20o15《盏10、Time4图322．324．PLD522．324．PLI-1322．2424．PL口522．2424．PLFig1-9ThelevelofHBeAginculturesupernatant35—30o夏25o身20o15《盏10、Time口522．2424．PL圈空白对照组D阴性对照组Fig1·10ThelevelofHBsAginculturesupernatant 研究论文。焉4兰厶壶3《Z口●>口口_一T硫‘‘。。‘。‘。。。’。1。。。一一1园322．324．PL}I"1522．324．PL口322．2424．PL口522．2424．PLFig1—11ThelevelofHBV-DNAinculturesupernatant420430440450460470480490：GGiCGAlCeCi^CjCCiCAjC6C6iiGC66＆C姓6IG6GiGGiGGi6GCi(Fig1-12TheSequencingresultsof322—324一PLs 研究论文1蛐150160CC?CCTCC[C7CTTGTCGC180190200G6i66iGGiGGe66iC[Fig1-13TheSequencingresultsof522_324-PLsFig1．14TheSequencingresultsof522_2424一PLs 研究论文101201如l40150TeIG一．．。GCTGGfG6cTCCGTTCG6。CGT。。。C，。GC1柏170180190：ffT^：fGi7簟7GiliTGl6灌ii6eG^j!：iGiGFig1-15TheSequencingresultsof322-2424一PLs27 研究论文附表TAB2-1ThelevelofHBsAginculturesupernatant幸comparedwithblankcontrolgroupP<0．05TAB2-2ThelevelofHBeAginculturesupernatant宰comparedwithblankcontrolgroupP<0．05 研究论文TAB2-3ThelevelofHBVDNAinculturesupernatant术comparedwithblankcontrolgroupP