细胞色素c的制备与测定课件

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1、细胞色素C的制备与测定细胞色素C的性质细胞色素（Cytochrome）是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，广泛存在于自然界，在各种动物，植物组织和微生物中都能找到。在生物氧化过程中，细胞色素是重要的呼吸传递体。细胞色素C（CytochromeC）又称细胞色素丙，简称细丙。主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。所以制备中多采用心肌和酵母作为提取分离细胞色素C的原料。细胞色素C是含铁卟啉的结合蛋白质。铁卟啉和蛋白质部分的比例为1:1。由碳、氢、氧、氮、硫、铁6种元素组

2、成。牛、马、猪、人心的细胞色素C蛋白质部分均由104个氨基酸组成，其中只有数个氨基酸不同，氨基酸中含有较多的精氨酸，故呈盐基性。猪心肌的细胞色素C含铁量为0.38～0.43％，相对分子质量12200，等电点pI为10.2～10.8。细胞色素C的结构中的辅基通过卟啉环上乙烯基的α-碳和酶蛋白的一SH基按1:1连接成硫醚键，其连接方式见下图。图细胞色素C的结构式细胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它可分为氧化型和还原型两种。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应。R一Fe3+R－Fe2+氧化型

3、细胞色素C还原型细胞色素C这里R代表细胞色素C分子中铁原子以外的卟啉蛋白部分。从以上反应式可见，当细胞色素C分子中的铁原子为三价时(Fe3十)，是氧化型的，但接受一个电子后变成二价铁（Fe2+），成了还原型的细胞色素c分子，电子一旦给出后又成了氧化型的。两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热较稳定，不易变性，在pH7.2～10.2时，加热至100℃3min，变性才18～28%。对酸碱比较稳定，可抵抗0.3mol／LHCl和0.1mol/LKOH的长时间处理。但三氯醋酸和乙酸可使之变性，引起某些

4、失活。其还原型较氧化型稳定，不易与一氧化碳（CO）、氰化钾（KCN）结合，故一般都制成还原型，比较稳定，易保存细胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低温保存，亦可保存于硫酸铵溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成冻干粉末，可保持活性数年。细胞色素C的临床作用细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细胞恢复正常呼吸，病情得到缓解或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。如用细胞色素C

5、治疗脑血管障碍、脑软化、脑出血、中风后遗症、脑动脉硬化症、脑外伤、婴幼儿百日咳、脑病、不可逆休克期缺氧、脑栓塞、脑震荡后遗症、乙型脑炎的神经精神症状、心代偿不全、心肌炎、狭心症、白喉心肌炎、肺心病、心绞痛、心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺气肿及支气管扩张引起的呼吸困难、一氧化碳中毒、安眠药中毒、麻醉前处理、新生儿假死、神经麻痹症等。对抗癌药物引起的白血球降低、四肢血行障碍、肝疾患、肾炎等亦有一定疗效。细胞色素C(Cyt.C)的制备及含量测定每组称心肌碎肉150g，加自来水300mL（水预先用6～7mL1mol/LH2SO4酸化）用1mol

6、/LH2SO4调pH3.8～4.0（需不断调整）搅拌提取1.5h用1mol/LNH4OH调pH6.0用四层纱布挤压过滤，收集滤液（暗紫色，浑浊），肉渣回收用1mol/LNH4OH调pH7.5～8.0，静置10～30min，使溶液分层虹吸上部溶液，过滤除杂质，下部浑浊液离心（4500rpm，5min）每人称人造沸石4g合并清液浮选平均分成两份自来水装柱上样（流速不大于10mL/min）Cyt.C吸附，沸石呈红色，流出液为黄色（或浅红色）依次用30mL自来水、去离子水、0.2%NaCl、去离子水洗柱用25%(NH4)2SO4洗

7、脱（流速小于2mL/min）收集红色洗脱液，量体积（控制在10mL左右）每100mL洗脱液加17g固体(NH4)2SO4，边加边搅拌至(NH4)2SO4完全溶解，并有沉淀析出将溶液置于小试剂瓶中，室温静置一周（接上周）滤纸过滤，收集滤液，量体积按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌Cyt.C形成可逆沉淀，立即离心（45000rpm，5min），收集沉淀若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀Cyt.C沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过5mL）溶解液装入透析袋对自来水、去离子水透析，用Ba(Ac)2检测透析袋

8、周围水的SO42-过滤除去不溶物,得到Cyt.C粗品液，量体积，测定其含量取5支试管，按以下步骤操作：试管编号12345标准液/mL00.50.50