细胞色素C的制备及其测定及思考题答案.doc

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1、细胞色素c的制备及其测定及思考题答案一、实验原理1、通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤；2、掌握制备细胞色素C的操作技术及其含量的测定方法。二、实验原理：细胞色素C的特点与实验原理三、实验器材、材料及试剂：1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱(2.5cmX30cm)＞透析袋、纱布、广泛PH试纸、精密PH试纸、烧杯(2000、1000＞500mL)＞量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、材料:(1)新鲜猪心、(2)人造沸石(60〜80目)、(3)0.25mol/LNaOH和lmol/LNaCI混合液、(4)0

2、.2%NaCI,12%BaCI2,20%TCA,2mol/LH2SO4、(5)0.06mol/L磷酸氢二钠、0.4mol/L氯化钠、(6)l%BaCI2三、实验步骤：1、细胞色素C的制备：2.细胞色素C含量的测定：根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性,作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率來求得所测样品的含量。具体操作如下：(1)标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液(3.24mg/mL)。按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管屮加入的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各

3、管的光吸收值(A520nm),如图：(2)样品测定取纯化后的细胞色素C液lmL加水3mL,混匀，测A520nmo如果光吸收值不在标准曲线范围内(0〜0.30),应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。五、结果计算：实验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x)：样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)：样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。细胞色素C的含量二细胞色素C的浓度X稀释倍数X终体积=0.266xl

4、x5.40=1.44mg六、思考题：2、制备细胞色素C通常选取什么动物组织？为什么？答：釆取动物的心脏或着酵母；因为细胞色素C是呼吸链中极重要的电子载体，主要存在于线粒体中，动物的心脏需氧量较大，因此细胞色素C含量也较大。2、本实验采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸钱溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素及含量测定，各是根据什么原理？答：酸溶液提取：细胞色素C易溶于水和酸性溶液；人造沸石吸附：物理吸附，沸石的多孔结构能够吸附溶解的细胞色素C；硫酸钱洗脱：（未冇明确答案，待询问老师）三氯乙酸沉淀:低浓度的三氯乙酸可使细胞色素C产生可逆变性沉淀,通过离心可

5、将其分离，加入清水后又可复性。3、试以细胞色素C的制备为例，总结蛋白质制备的步骤和方法。答:步骤：从组织中初步提取一分离纯化一检测提取：组织研磨、细胞破碎等；分离纯化：层析、过滤、离心、洗脱、沉淀等；检测：吸光光度法、电泳。4、在本次实验屮如何确定称取一定量的沸石上柱？答：根据玻璃柱的直径大小以及2/3长度，计算出所需沸石的体积，再根据沸石的密度，即可算出所需沸石的重量，用天平称取即可。六、实验注意事项及遇到的问题（1）注意事项：1）提取、屮和步骤耍注意调节PHo吸附、洗脱步骤应严格控制流速；2）盐析时，硫酸鞍应多次少量加入，边加边搅拌；3）逐滴加入硫酸钱

6、，摇匀，尽快离心，长时间会导致细胞色素C永久变性。(2)问题：1)在调节PH时很难调节到所需PH,在试验中曾经加入大量酸后没有见精确PH试纸显示相应的PH,用普通PH试纸则显示过酸，当加入碱后，也没有显示出相应的PH,在本次实验中，我们组调节的PH没有达到预期的效果,没冇精确到要求，且导致肉糜的颜色较黯淡。