GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用PPT课件.ppt

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1、GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用中国医科大学实验病理学教研室前言动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)一直被认为是一种慢性进展的血管壁脂质沉积性疾病。近些年的研究逐渐阐明了炎症在AS病理过程中的重要作用。炎症学说认为，炎症可导致不稳定斑块形成，斑块破裂甚至急性冠状动脉综合症（acutecoronarysyndrome,ACS）等临床严重并发症的发生。而不稳定斑块的重要特征之一就是斑块内血管新生。斑块内血管新生与斑块不稳定之间的关系已逐渐成为当前研究的热

2、点。血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的过程，见于许多生理和病理情况。血管新生的过程极其复杂，受到促进血管生成因子和抑制血管生成因子的共同调控。AS斑块内的新生血管主要来自外膜血管滋养管（vasavasorum）。通过新生血管，血液中的血浆脂蛋白和大量炎细胞流入斑块内，加重炎症反应。新生血管本身无平滑肌和周细胞支持，管壁薄弱，易于引起斑块内出血、斑块破裂甚至一系列临床严重并发症的发生。实验目的研究炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolo

3、nystimulatingfactor,GM-CSF）对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的作用。探讨GM-CSF和VEGF与AS斑块稳定性及病变进展之间的关系。实验方法原代培养HUVECs应用Matrigel建立稳定的血管形成的体外培养体系。Matrigel的用法：Matrigel冻存于-20℃，使用前置于4℃过夜，融化成黄色胶状液体。根据本实验研究所得的经验：用预冷的微量进样器在短时间内迅速加入预冷的

4、24孔板中，每孔80μl/cm2（厚度约为0.5mm）。轻轻摇晃培养板，使其铺平。最后将培养板放入37℃孵育箱内，30分钟后即可使用。HUVECs原代培养:采用本实验室改进的Jaffe氏培养法。取健康新生儿脐带（最好不超过12h），PBS冲洗干净，0.25%胰酶消化（37℃，5分钟），用含5%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，收集消化液。离心（1000转/分钟，10分钟）。弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以5.0×105/cm2接种于涂有Matrigel的培养板内进行培养

5、,24小时后换液。实验分组GM-CSF作用的检测本实验根据不同的实验因素浓度和不同的作用时间，分别设计成浓度效应组和时间效应组。浓度效应组：正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF不同浓度组（25、50、100ng/ml），分别作用48h。时间效应组：取相同浓度rhGM-CSF（100ng/ml）不同作用时间组（12、24、48h）。VEGF作用的检测正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF（100ng/ml）组、rhGM-CSF（100ng/ml）+VEGF165（10

6、ng/ml）组，分别作用24h。相差显微镜下观察各实验组血管腔形成情况。各实验组用95%冰乙醇固定，4℃过夜。用CD34免疫细胞化学方法（SP法）显示各组血管形态。计数管腔数并进行统计学分析每个实验组在40倍镜下选取3处血管密集的视野，100倍镜下计数每个视野的管腔数。应用SPSS、microsoftexcel进行统计分析和处理。P<0.05为有统计学意义。实验结果Matrigel对体外培养人脐带静脉内皮细胞形成血管的诱导作用本研究提示，应用Matrigel可在体外诱导培养的人脐带静脉内皮细胞形

7、成管腔结构。内皮细胞在培养后18小时开始形成管腔结构，24小时即可建立稳定的血管形成的体外模型。图1在普通明胶上培养的人脐带静脉内皮细胞24小时形态，内皮细胞呈短梭形或多角形，达到亚融合（倒置相差显微镜x100）图2Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小所建立的血管形成的体外模型（倒置相差显微镜x100）图3Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小时所建立的血管形成的体外模型（CD34免疫细胞化学染色x100）本研究提示，与在普通明胶上生长的内皮细胞相比，在Matrig

8、el上生长的内皮细胞生长周期较短，并且细胞不发生融合，而是形成相互连接的毛细血管样的血管网络。细胞间界限不清。不同浓度GM-CSF作用的检测图4正常对照组作用48小时形成的管腔数较少（倒置相差显微镜x100）图5rhGM-CSF（25ng/ml）作用48小时形成的管腔数有所增多（倒置相差显微镜x100）图6rhGM-CSF（50ng/ml）作用48小时形成的管腔数进一步增多（倒置相差显微镜x100）图7rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小时形成明显的管腔结构，连接成血管网络（倒置相差显