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《植物生物工程实验二(植物dna的提取)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、植物生物工程实验植物DNA提取、质量检测及特定基因片段操作综合实验二郝大海实验目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法了解PCR原理，熟悉操作步骤掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法保证DNA一级结构的完整性排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等DNA提取的原则实验原理（DNA提取）DNA存在部位主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在基因组DNA的提取CTAB法SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法DNA提取的方法在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,D
2、NA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种: ①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA. ②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核
3、酸分离,从而从材料中直接提取出DNA. ③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀CTAB法原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl），该复合物可溶的有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTABCTAB提取缓冲液的经典配方组份Tri
4、s-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入SDS法原理SDS阴离子去垢剂高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDS组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方DNA提取基本步骤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存基因组DNA新鲜材料，低温保存细胞
5、培养时间不能过长材料准备基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨培养细胞－－蛋白酶K细胞裂解采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法核酸分离纯化多糖的去除：多糖水解酶蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结
6、合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发核酸沉淀若长期储存建议使用TE缓冲液溶解pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA质量检测紫外分光光度计检测法 嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280
7、大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。测定结果分析琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的
