植物DNA提取实验方案.doc

《植物DNA提取实验方案.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、植物DNA提取实验方案1、了解真核生物基因组DNA捉取的一般原理。2、掌握DNA提取的方法和步骤。原理:提取DNA的一般原理，是将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇提取的方法去除蛋白质，得到的DNA经过乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样吊提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用而细胞破碎液中的蛋白酶K在37°C温浴过程中还能降解蛋白质从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理在特定的盐浓度下CTAB使基因组DXA处于溶解状态而蛋白质

2、仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DM粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理其中酚是高效的蛋白变性剂可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉然后用氯仿、异戊醇处理一方而可达到去蛋白的目的另一方面还可去除残留的酚。—、材料植物的根、茎、叶。最好选择叶子部分做实验。二设备移液管，冷冻高速离心机，台式高速离心机，陶瓷研钵，1.5mL离心管。三、试剂1、CTAB或Nacl溶液4.1克NaCl溶解于80ml水缓慢加入10克CTAB加水至100mlo2、其它试剂氯仿、异戊醇241酚氯仿异戊醇25241异丙醇TE10%SDS蛋白酶K20mg/ml5mol/LNaClo!1!1、选新鲜无病虫害的叶片用自來水冲洗吸干用蒸憎

3、水洗两次然后用超纯水洗一遍吸干剪碎称0.5-0.25克°2、将所取材料放入预冷的研钵研钵提前要灭菌研成粉末后置于7M离心管内可以换为将样品放置到7ml离心管中SOOul后用玻棒捣碎。3、加入2.4ml65°C预热的CTAB充分混合后65°C水浴90min以上冷却到室温加入等体积氯仿异戊醇241轻轻颠倒混匀4°C离心6000gXlOmin取上清加入2/3体积的-20£预冷的异丙醇轻轻混匀-20°C度放置20min4°C离心5000gX5min去上清。4、再沉淀中加入0.6ml的65°CCTAB温育30min待沉淀充分溶解加入等体积氯仿异戊醇充分混匀4°C离心6000gX5min去上清加入2

4、/3体积的-20€预冷的异丙醇轻轻混匀-20°C放置20mino4°C离心5000gX5min去上清。5、用70%乙醇清洗沉淀两次真空抽T•加入200u1TE溶解DNA后置于4°C备用。6、提示：酚、氯仿、异戊醇的作用：酚与氯仿是非极性分子水是极性分子当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大经过离心与水相分离沉淀在水相下面从而与溶解在水相中的DNA分开而酚与氯仿有机溶剂比重大保留在最下层。作为表面变性剂的酚与氯仿在去除蛋白质的作用小各有利弊。酚的变形作用大但酚与水能有一定程度的互溶因而损失了这部分水相中的D

5、NAo氯仿的变形作用不如酚效果好但氯仿不与水相容不会带走DNA所以在抽提过程小混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相小有残留的酚由于酚与氯仿是互溶的可用氯仿第二次变性蛋白质此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合（1:1）使用。异戊醇能降低分子•表面的张力可以减少抽提过程小的泡沫产生同时异戊醇有助于分相使离心后的上层水相中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。聚合酶的链式反应（PCR）1.掌握PCR技术的一般方法和原理。2.了解PCR的应用。实验原理:类似于DNA的体内复制，首先将扩增的DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶

6、序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性■复性■延伸的过稈就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。材料：模板DNA为前次提取的质粒。仪器：移动器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增议，琼脂糖凝胶电泳所需设备（电泳槽及电泳仪），台式高速离心机。试剂:1、lOxPCR反应缓冲液:500mmol/LKCIJOOmmol/LTris-CI,在25摄氏度下,PH9.0z1.0%TritonX-100o2、MgCI2:25mmol/L3、4种dNTP混合物：每种2.5mmol/L4、TaqDNA聚合酶5U/ul5、引物1和引物2的浓度均为

7、10umol/l6、其它试剂：矿物油（石蜡油），1%琼脂糖，5Xtbe操作步骤:一、PCR反应DNA模板0.8uL5'端引物2uL3'端引物2uLlOxPCR缓冲液（不含MgC12）2.5uLlOmmol/LdNTP0.5uL25mmol/LMgC121.5uLTaqDNA聚合酶0.5U1H2015.2U1混合后离心5秒二、PCR反应条件：先94摄氏度预变性5-10min,94摄氏度变性lmin,53摄氏度退火lmin,72摄氏度延