prrsv经典株与nsp2变异株rtpcr鉴别诊断方法的标准操作规程

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1、PRRSV经典株与Nsp2变异株RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作规程（检验SOP）1.适用范围本标准规定了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）经典毒株与Nsp2基因缺失株的特异性逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）区分技术。木标准适用于疑似感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪的组织、血液及其他病料样品。2.试剂2.1天根公司TIANampVirusRNAKit病毒RNA提取试剂盒，目录号：DP315-R2.2赛百盛公司goldview2.3天根公司QuantOneStepRT-PCRKit,目录号：KR1132.4琼脂糖2.5分析纯酒精（99

2、.7%）2.66>

3、rDL1000)2.操作步骤5.1样品处理处理材料：材料为发病猪只血液、血清或淋巴液可直接吸取140(iL。材料为细胞上清液，叫直接使用140

4、liL新鲜上清混匀。材料为贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，反复冻融三次，然后3000r/min离心5min，取上淸液140

5、iL。材料为病猪肺脏、淋巴结、扁桃体等病料样品时，需要先用生理盐水或PBS进行研磨，收集研磨物后反复冻融3次，12000r/min离心lOmin，取上清140(止。5.2用移液器将560(iLCarrierRNA工作液(为裂解液RL与CarrierRNA溶液的混合液，配制方法如附录

6、配液表配制)加入一个干净的1.5mL离心管中。注意：如果样本体积大于140ML,可等比例增加工作溶液和无水乙醇的用量。5.3向离心管中加入140)iL检测样品(样品需平衡至室温)，涡旋振荡15秒混匀。注意：为了保证裂解充分，样品和CarrierRNA工作液需要彻底混匀。5.4在室温(15-25°C)孵育10分钟。5.5简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.6加入560pL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒。注意：如果周围环境高于25°C，乙醇需要在冰上预冷后再加入。5.7简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.8仔细将离心管中的630^L液

7、体转移至RNase-free吸附柱CR2(吸附柱放在2mL收集管中)，盖上管盖，6000xg(8000rpm)离心1分钊弃废液，将吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中，如为组织苗，在过柱前请离心后将上清液过柱。5.9重复此步骤7。5.10小心打开吸附柱盖子，加入500(iL溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，6000xg(8000rpm)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。5.11小心打开吸附柱盖子，加入500(iL溶液RW(使用前请先检查是否已

8、加入无水乙醇)，盖上管盖，6000xg(8000rpm)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放冋收集管。5.12将吸附柱放回收集管中，13,400xg(12,000rpm)离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液。5.13可选步骤：将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干。5.14将吸附柱放入一个RNase-free超净离心管(1.5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，向膜屮央加入60)iLRNase-freeddH2O,盖上盖子，室温放置5分钟。6000xg(8000rpm)离心1分钟。5.15可选步骤：将上一步骤的洗脱液再

9、次加入膜中央，并6000xg(SOOOrpm)离心1分钟，以增强RNA洗脱效果。注意：确保洗脱液(RNase-freeddH2O)在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小(小于50PL),为了将膜上的RNA充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位置。洗脱体积可以根据后续的实验要求灵活处理，洗脱液(RNase-freeddH2O)加到吸附柱后，离心前在室温放置5分钟，有助于提高RNA的产量。5.16将提取的RNA样品按照下条件进行RT-PCR，剩余部分请及吋放入-80°C保存(所有配置工作均在冰上进行)。检测设阴、阳性对照。配置如下体系：(2

10、5

11、iL体系)Rnase-freeddH2O8.75(iL10xRT-PCRbuffer2.5)iLdNTPMixtureI.OjiL5