载脂蛋白e基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化

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1、载脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化　　成纤维细胞作为动脉外膜最主要的细胞成分，在环境因素发生改变时具有调整其表型的能力。在血管内皮损伤的模型中，外膜表现出了显著增厚，其主要就是由于外膜成纤维细胞转化成肌成纤维细胞聚集引起的。但是关于动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞表型转化的报道甚少，本研究将通过整体动物及体外实验观察载脂蛋白E基因敲除(ApoE－/－)小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化，探讨血管外膜成纤维细胞表型转变在早期动脉粥样硬化病灶形成中的作用。　　1、材料与方法　　1.1主要材料　　6

2、周龄ApoE－/－小鼠和C57BL/6鼠购于北京大学医学部。DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibicol公司。兔多克隆抗体转化生长因子β1(transforming　groentin)抗体、抗小鼠结蛋白(desmin)抗体及抗小鼠α平滑肌肌动蛋白(α-smooth　muscleactin，α-SM-actin)抗体购于美国NeoMarkers公司;鼠组织免疫组织化学试剂盒购于福州迈新试剂公司;兔即用型SP免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司;链霉亲和素

3、-生物素-异硫氰酸酯(streptavidin-biotin　plex-fluoresceine　isothiocya-nate，SABC-FITC)及链霉亲和素-生物素-cy3(streptavidin-biotinplex-cy3，SABC-cy3)试剂盒购于武汉博士德公司。DAPI购于美国Sigma公司。　　1.2标本制备　　6周龄ApoE－/－小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分别给予高脂饲料(基础饲料84.75%，饱和脂肪15%，胆固醇0.25%)喂养2周、4周和8周。在各个时间点处死动物后取升主动脉

4、用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制备连续切片。　　1.3免疫组织化学染色　　选取部分切片进行免疫组织化学染色检测α-SM-actin和Vimentin的表达，按鼠组织免疫组织化学试剂盒说明书操作。按兔即用型SP免疫组织化学试剂盒说明检测Desmin的表达。部分切片进行免疫荧光染色检测TGF-β1的表达，按SABC-cy3试剂盒说明书操作，显微镜下观察采集图像。　　1.4血管外膜成纤维细胞的培养　　6周龄野生型C57BL/6小鼠和ApoE－/－小鼠，高脂喂养2周后，颈椎脱臼处死，无菌开胸取出整

5、条主动脉，仔细清除血细胞及血管周围脂肪组织，解剖显微镜下小心剥离外膜。用眼科剪将组织剪碎成约1mm3小块，接种到培养瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2干涸培养2～4h待组织块贴牢后轻轻翻转培养瓶继续静置培养，观察大部分组织块周围爬出细胞，融合成片时，用0.25%胰蛋白酶消化并采用差速贴壁法纯化两次。　　选取第3～5代细胞，进行后续实验。　　1.5免疫荧光染色检测体外培养成纤维细胞中Vi-mentin、α-SM-actin和Desmin的表达　　　　取对数生长期细胞，0

6、.25%的胰酶将细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5108cells/L，接种于带爬片的6孔板中，静置培养48h待细胞长至亚融合状态后，血清饥饿24h，然后更换含有10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，弃去培养液，取出细胞爬片。PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS冲洗3遍，3%过氧化氢室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶。之后Vimentin免疫荧光染色按SABC-FITC试剂盒进行，α-SM-actin及Desmin免疫荧光染色按SABC-cy3试剂盒进行。　　1.

7、6透射电镜观察细胞超微结构　　取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液，调整细胞浓度为5109cells/L，接种于新培养瓶中，后静置培养48h待细胞长至亚融合状态，血清饥饿24h，更换含10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，然后收集细胞［约(15～20)106个培养细胞］，经过固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色后透射电镜下观察细胞超微结构。　　1.7-actin及TGF-β1蛋白的表达　　收集细胞加入100μL细胞裂解液，冰上孵育20min，10000g离心5m

8、in，取各组细胞的裂解液10μL，各加入5μL上样缓冲液，混匀。水中煮沸3～5min，10000g离心1min，冰上放置，上样。经电泳、考马斯亮兰染色、脱色，转膜，封闭后加入一抗α-SM-actin或TGF-β1，4℃杂交过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1h，洗膜，化学发光法显色。结果作半定量分析。　　1.8统计学分析　　检测结果均用x&plusm