载脂蛋白E基因敲除小型猪的建立及肝脏表型分析

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1、分类号：Q95-33单位代码：10183研究生学号：2015882004密级：公开研载脂蛋白E基因敲除吉林大学小型猪硕士学位论文的建立（学术学位）及肝脏载脂蛋白E基因敲除小型猪的建立及肝脏表型分析表型KnockoutApolipoproteinEgeneofGuangxiMinipigto分析buildAtherosclerosisModels&HepaticPhenotypeAnalysis立作者姓名：沈梓盈沈专业名称：动物学梓盈领域（方向）：基因编辑动物模型指导教师：任文陟培养单位：动物科学学院2018年6月吉林大学载脂蛋白E基因敲除小型猪的建立及肝脏表型分析

2、KnockoutApolipoproteinEgeneofGuangxiMinipigtobuildAtherosclerosisModels&HepaticPhenotypeAnalysis作者姓名：沈梓盈专业名称：动物学指导教师：任文陟教授学位类别：理学硕士论文答辩日期：2018年6月4日中文摘要载脂蛋白E基因敲除小型猪的建立以及肝脏表型分析在我国尤其是北方城市，心脏血管疾病有着非常高的发病率和致死率，这和环境及民众的饮食结构有很大关系。动脉粥样硬化是以冠心病、脑梗死等心血管疾病的主要诱因，主要由脂质代谢紊乱造成。动脉粥样硬化不仅和脂质代谢、炎症反应相关，而且

3、和高胆固醇血症的关系十分密切。动脉粥样硬化属于慢性病，诱发因素较多，一旦发病严重时可以致命。1973年人们在超低密度脂蛋白中发现了载脂蛋白E在血浆脂蛋白代谢中具有重要作用，可以调节酶活性、运输脂质、引导血浆脂蛋白同细胞表面受体结合。ApoE的多态性不仅可以影响其结合脂质能力，而且和神经退化疾病、心血管动脉粥样硬化疾病有相关性，且不同亚型对疾病的易感性也不同。ApoE和疾病的关系在动物身上研究较为广泛，如apoE基因敲除鼠和apoE基因敲除兔的胆固醇水平都显著升高，可以发展为高脂蛋白血症、动脉粥样硬化。但是这些转基因动物模型也并是完美的动脉粥样硬化模型。鼠模型体积过

4、小，不适合采样和外科手术操作，而且脂蛋白以HDL为主，对动脉粥样硬化有保护作用；兔子模型虽然易于操作，但对饮食敏感，而且缺少肝脏酶活性，长期高胆固醇饮食会导致肝脏中毒，斑块损伤位置和人类也不同。如果能建立体积合适，基因性状、代谢功能和人类更相似的动物模型，对研究人的动脉粥样硬化疾病以及其和apoE的关系意义重大。人类的基因组和猪最为相似，而且猪和人类的心血管系统生理解剖学结构也很相似。很多研究表明猪也易患高血压、高血脂等与人类极为相似的心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化。不仅如此，小型猪的血管斑块损伤分布情况、成熟斑块特点也和人类基本一致。更重要的是小型猪体积适中，易

5、于操作，实用性强。本论文主要采用新的基因编辑技术CRISPR/Cas9，目的是敲除巴马香猪胎儿成纤维细胞中apoE基因，筛选出敲除成功的单克隆细胞后，通过体细胞核移I植、胚胎移植技术，建立apoE基因敲除小型猪模型。我们通过分析新生仔猪肝脏中脂质含量、蛋白表达以及其他相关基因转录水平检测，我们发现新生仔猪跟野生型相比：1）apoE的mRNA水平几乎为0，westernblot结果也显示肝脏内无apoE蛋白表达；2）肝脏的胆固醇含量、甘油三酯水平更高，游离脂肪酸含量、HDL-C和LDL-C差异不显著；3）脂质代谢调节因子PPAR水平差异不显著、SRBⅠ的表达水平低，

6、脂肪酸酶FADS1、FADS2表达量较低；4）抗炎因子IL-4、IL-10表达水平低，而炎性因子IL-6、MCP-1无太大差异，TNF-α、IFN-γ表达水平高。从这些数据我们可以看出，apoE基因敲除后，新生仔猪和野生型相比，肝脏胆固醇和甘油三酯含量都相对较高，调节脂质代谢的脂肪酸酶和具有协助反转运胆固醇功能的SRBⅠ表达水平较低，说明肝脏内脂质会不断积累，对身体健康形成负担；而炎性因子TNF-α、IFN-γ表达量高，抗炎因子IL-4、IL-10表达量低，说明apoE基因敲除猪的炎症反应会加剧。胆固醇和甘油三酯不断积累，胆固醇和脂肪酸代谢能力降低，炎症因子的大量

7、表达，这些都会形成并推进动脉粥样硬化的发展，这种模型是研究人动脉粥样硬化和apoE关系的最理想模型，对治疗和预防动脉粥样硬化都具有指导作用。关键词：载脂蛋白E、动物模型、CRIPSR/Cas9系统、肝脏、脂质、炎症。IIAbstractKnockoutApolipoproteinEgeneofGuangxiMinipigtobuildAtherosclerosisModelsInourcountry,especiallynorthcities,cardiovasculardiseaseshavehighmorbidityandmortalitywhichrelat

8、edtoe