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《溶菌酶作用机理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、裂解酶PlySs2裂解细菌的作用机理研究1.实验目的PlySs2是从猪链球荫｛Strept()c()ccussuis｝噬荫体巾分离到的一种裂解酶，对甲氧西林耐药念黄色葡萄球菌(MethicUlin-resistantstreptococcusc/w/rwA-,MRSA)＞万古霉素屮介耐药金货色葡萄球苘(Vancomycin-intermediate价印/队仇.dm"5V1SA)、粘链球荫、乎斯特菌｛Listeria)、模｛//葡菊球菌(Streptococcussimulans)等细菌具有抑制iS•
2、性，讯性高，抗菌谱广［1'2］。研究发现，PlySs2由两个功能结构域构成，即催化结构域(Catalyticdomain,CD,PlySc)和细胞壁结介结构域(Cellwallbindingdomain,CBD,PlySb)H’21。CBD结构域负责与细胞壁上相应基质结合，CD结构域侧催化相庖的化学反疢促使细胞壁上特定物质分解，从而破坏细胞蜡结构儿裂解细胞。PlySs2的N端为半胱氨酸-纟II氨酸氨基水解酶(Cysteine-histidineamidohydrolase/peptidase,CHAP
3、)催化结构域，C端为SH35型结合结构域。CHAP结构域即具有丙氨酸酰胺酶活性，也具有肽桥内切酶活性［2］。研究发现，以有完整的PlySs2才能保持艽较高的溶歯活性，PlySs2属于结合结构域PlySb依赖型，单独的催化结构域PlySc的溶解活性很小或者基木无活性说明PlySb对底物的识別十分重耍。PlySs2能识别多种菌的细胞壁丼产生裂解活性，何是不同菌之间存在活性差异，这即体现了其广谱性，乂体现了活性差异性。相关报道表明，多数裂解酶与细菌细胞壁中肽聚糖的特定位点结合并破坏其结构，从而裂解细蘭。不同
4、菌株之间细胞娥的组成成分具宥差异，导致裂解酶存在活性差异［鬥前推测，PlySs2的结合位点在细胞壁肽聚糖上，并破坏艽结构以裂解细歯。木研究的M的是找到PlySs2与肽聚糖相互作用的结合位点，分析PlySs2裂解细菌的作用机理。2.实验思路根据实验室己有的方法诱导表达和纯化PlySs2,备川。选择PlySs2裂解活性最尚的金黄色葡萄球菌作为实验菌，在最适条件K培养并获得菌体。实验思路一：PlySs2直接与金黄色葡萄球菌相互作用。在敁适条件下孵育PlySs2和金黄色葡菊球齒的混介物，离心并收集上清液。由
5、于PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁上某种物质相互结合并反应，可能存在PlySs2与底物结介在一起的复合物，离心后收集上淸液，其屮可能存在少景该复合物，再采川非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测分析。若与空白对照比较有特异性条带岀现，回收产物并分析其中的物质成分。方法特点：简单易行，但可能上清液中PlySs2与底物结合的S合物含虽较低，无法检测出来。实验思路二：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁相互作用。若实验思路一无法找到PlySs2的结合底物，则进一步提取金黄色葡萄球荫的细胞壁，
6、直接让PlySs2与细胞壁反应，反应方式有两种：（1）在最适条件下孵育PlySs2和细胞壁的混合物，离心后收集上清液，采用非变性聚内烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测分析。若与空闩对照比较有特异性条带出现，1叫收产物丼分析tt:中的物质成分；（2）找到合适的万法固定PlySs2,然后固定化的PlySs2与细胞壁反应，分离岀固定化的PlySs2与细胞壁成分结合的复合物,再从PlySs2上解离出结合底物，收集底物并鉴定。方法特点：提®了PlySs2底物的浓度，减少了细胞内容物对结合反应的影响，但
7、细胞壁提取过程中有可能破坏其天然结构，可能影响PlySs2与底物的结合,固定化PlySs2也冇可能影响艽结合位点的结合活性。实验思路三：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁单一成分相互作用。1.实验方法1.1.PlySs2的诱导表达和纯化PlySs2的诱导表达和纯化参考黄燕玲的毕业论文
8、41。1.2.金黄色葡萄球菌细胞壁的提取和纯化采川超声波法提取细胞梢
9、5'61,具体操作步骤如卜*。（1）菌体收集：在Baird-Parker培养基中培养金黄色葡萄球菌。培养完毕后，迅速降温至4"C（冰浴），在4'C下3
10、000r/min离心20min,收集菌体沉淀。4°C蒸馏水反复洗涤荫体至0色，收集苘体，置于10CTC沸水中灭活20min。（2）超声波细胞破碎：条件为超声功率400W、超声时闽30min、超声温度40°C。（3）细胞壁收集:超声处理过的混合液在3000r/min卜*离心20min,去除未破碎的菌体沉淀，收集上淸液，12000r/min离心15min,收集沉淀即为细胞壁。1.3.PlySs2与细胞壁的结合实验方法一:1.实验材料1.1.菌株和质粒PlyS
