胃癌中mir-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制研究

《胃癌中mir-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、胃癌中miR-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制研宄1.河南省安阳地区医院4550002.屮国人民解放军火箭军总医院100088国家自然科学基金项目:低剂量辐射对树突状细胞迁移能力影响及其分子机制研究，课题编号:81202151［摘要］目的：阐释胃癌屮miR-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响，并证明它可能是通过影响细胞骨架调节蛋內VASP的表达水平来抑制胃癌细胞侵袭和迁移的分子机制。方法：通过Westernblot检测VASP蛋白表达水平；划痕损伤修复实验检测H癌细胞迁移能力；构建Pc

2、DNA6.2-miR-638的真核表达载体，转染入胃癌细胞BGC-823,过表达miR-638,通过划痕损伤修复实验检测癌细胞迁移能力.结果：与对照组相比，过表达VASP3’UTR使VASP蛋白水平增加(P<0.05)；过表达VASP3’UTR能促进胃癌细胞迁移(P<0.05)；与对照组相比，过表达miR-638抑制胃癌细胞的迁移(P<0.05);结论：过表达VASP3’UTR增加VASP蛋白水平，促进胃癌细胞的迁移；过表达miR-638能抑

3、制胃癌细胞的迁移；miR-638直接靶向VASP3’UTR抑制胃癌细胞的迁移。［关键词］胃癌；miR-638；血管扩张刺激磷蛋0;迁移；侵袭本文用芯片筛选胃癌和癌旁组织的micmRNA差异表达谱1-2,发现miR-610、miR-638下调倍数分别为0.522和0.283;生物信息学软件分析发现miR-610、miR-638可以与VASPmRNA3’非翻译区不完全互补配对；本实验以miR-638为契入点，培养胃癌细胞BGC-823,利用westernblot、PCR、划痕

4、损伤修复实验、luciferase报告基因实验等实验技术，证实外源性过表达VASP3’UTR能促进R癌细胞侵袭转移3。1材料与方法1.1材料主要试剂：DMEM培养基；胎牛血清；胰蛋白酶；EDTA-Na2.2H2O;十二烷基磺酸钠Sigma；N,N,-亚甲双丙烯酰胺Fluka；丙烯酰胺Amresco；TEMEDSigma；单克隆鼠抗人VASP抗体AlexisBiochemicals；兔抗人GAPDH抗体Santacruze；HRP或AP标记的羊抗鼠IgGSantacruze;HRP或A

5、P标记的羊抗兔IgGSantacruze；BCA蛋白浓度测定试剂盒北京普利莱公司；DAB显色试剂盒北京天根公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。主要仪器：显微镜：XDS-1B倒置显微镜，北京顺杰欣隆有限公司；DMBRI倒置相差荧光显微镜:LEICA,Germany；BIO-1D凝胶成像系统:法国VilberLourmat公司；超声破碎仪：美国Sonics&Materials公司；凝胶成像分析系统:Syngene;PCR仪:Eppendorf；SpectraMaxM2多功能酶标仪：Molecular

6、Devices,USA；其余仪器均为国产。胃癌细胞BGC-823:BGC-823细胞由我院保存。质粒：pcDNA6.2-miR-GW/EmGFPvector购自invitrogen。菌株：DH5α,本实验室保存。引物：定购自invitrogen公司。1.2实验方法真核表达载体pcDNA6.2-VASP3’UTR的构建：参考文献［4-5］方法制备载体PCDNA6.2大片段；以质粒pCMVSPORT-VASP-cDNA为模板，扩增大小为803bp的VASP3’UT

7、R目的片段；用DNA纯化试剂盒回收目的基因酶切后产物。挑取单克隆菌落，37°C摇床振荡培养12〜16hr(250rpm)，次日提取质粒pcDNA6.2-VASP3’UTR，送英骏公司(Invitrogen)测序。测序结果冋来后，取测序结果正确的pcDNA6.2-VASP3’UTR质粒做转化，然后使用北京天根公司的质粒小提试剂盒提质粒。真核表达载体pcDNA6.2-miR-638的构建：步骤同上。细胞培养：细胞的换液和传代：胃癌细胞MKN-28和BGC-823用1640培养

8、基+10%的胎牛血清+1%的双抗的完全培养基培养，每次换液用无菌PBS洗细胞一到两次，再加入培养基培养；待细胞长至80%~90%满吋，用胰蛋白酶消化传代。细胞的冻存：先制备细胞冻存液，选对数生长期的细胞，用胰酶消化细胞，制成细胞悬液，移入冻存管，放入冻存盒至-80°C冰箱，24小吋后取出，放入盒子-80°C保存。脂质体法将重组的质粒瞬时转染入胃癌细胞：细胞铺六孔板：六孔板每孔铺5×105细胞,加入2ml无抗生素的培养基，37°C,5%CO2培养24小吋，待细胞生长融合至70%〜80%