tdg蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

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时间:2018-10-28

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1、TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备:李石营,兰燕,唐波,华子春【摘要】目的:表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体。方法:PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体,表达并纯化HismTDG融合蛋白。用纯化的HismTDG蛋白免疫兔子产生抗血清,进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体,并检测分析制备的抗体在ethods:MouseTDG(mTDG)plifiedbyPCRandthenTDGproteinmunizerabbit.Purifiedantibodyatographycolumn,andit

2、sapplicationsmunofluorescenceanalysis.Results:HismTDGfusionproteinostallsolubleatloperature(20℃)andlomol·L-1).Thefusionproteinmunizerabbits,theantibodyagainstTDGmunoassays.Conclusion:O1和SUMO3相互作用,而且能够被它们共价修饰[10-12],SUMO化修饰影响了TDG的结构和酶活特征,是TDG发生错配修复过程中所必需的生物学事件[13],HeLa细胞样品的O条带,大约86kD[13

3、]。另外,研究报道,TDG定位在细胞核内[10,14]。  为了开展对TDG的研究,我们自己表达并纯化了鼠源的TDG蛋白,并用纯化的蛋白免疫兔子制备了高滴度的多克隆抗血清,进一步亲和纯化抗血清,获得了高质量的antiTDG多克隆抗体,制备的抗体能够在SF)重悬菌体,超声裂解20min(脉冲5s,间隔10s),13500×g离心15min。将收集的上清以0.5ml·min-1的速率加载到TrisHCl缓冲液预平衡的Ni+亲和柱,上样完毕后用TrisHCl缓冲液充分洗涤至基线,再分别用含有10mmol·L-1和50mmol·L-1咪唑的缓冲液洗涤杂蛋白,最后用含250m

4、mol·L-1咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。通过Ni+亲和柱纯化的洗脱蛋白立即使用SephadexG15凝胶柱层析去除咪唑。纯化后的蛋白加入10%的甘油后,保存在-80℃。  1.2.3TDG的活性分析TDG的活性分析参照文献[15]进行,T44(5′aattgggctcctcgaggaattTgccttctgcaggca  tgccccgg3′)在5′端用[γ32P]ATP标记,然后与G44(5′ccggggcatgcctgcagaaggcGaattcctcgaggagcccaatt3′)退火形成异源双链,即测活反应的DNA底物。测活反应体系为:50mmol·

5、L-1TrisHCl(pH8.0),1mmol·L-1DTT,50μg·ml-1BSA,1mmol·L-1EDTA,3%甘油,DNA底物0.3nmol·L-1和适量的TDG蛋白,10μl反应体系37℃反应30min,加入1.1μl1mol·L-1的NaOH,90℃反应30min,迅速置冰上,短暂离心后,加入5μl测活loading(90%formamide,10mmol·L-1EDTA,0.1%xylenecyanol,0.1%bromophenolblue)。取10μl混合物用14%聚丙烯酰胺测序胶分离,Tyhoon9410ersham)进行扫描与分析。  1.2.4

6、多克隆抗血清的制备与纯化先取2~3ml兔子血液作为免疫前阴性对照,用完全弗氏佐剂乳化500μg纯化的TDG蛋白后,皮下多点注射在兔子的背部和颈部,2周后加强免疫,用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,在加强免疫3次后,用纯化的蛋白做ELISA检测抗体的效价,结果显示1只兔子效价很好,滴度大约为214,另1只的滴度不太好,大约为29。颈部采血处死兔子,收集血清。  先用IgGbinding缓冲液(10mmol·L-1TrisHCl,pH7.5)平衡ProteinA柱子,效价较高(214)兔子的血清样品上柱后吸附10min,然后用2~3倍体积的binding

7、缓冲液洗去杂蛋白,再用洗脱缓冲液(0.1mol·L-1glycinebuffer,pH2~3)洗脱,洗脱下来的IgG用1.0mol·L-1Tris(pH7.5)中和。产生的多克隆抗体加入0.02%的叠氮钠和20%甘油后,保存于-80℃。  1.2.5细胞培养和转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人胚胎肾细胞293T购自AmericanTypeCellCulture(ATCC),用含有10%小牛血清的DulbeccosmodifiedEaglesmedium(DMEM)培养。对于.蛋白Marker;Lane1~3.依次为未经I

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