microrna—29a 在脂多糖诱导人单核细胞凋亡中的作用和机制

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1、MicroRNA—29a在脂多糖诱导人单核细胞凋亡中的作用和机制　　脓毒症（sepsis）具有患病率高、病死率高、治疗费用高等特点［1-3］，是目前重症医学领域最受关注的临床难题之一。而脓毒症的发病机制仍欠清晰，免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重要环节，其中免疫细胞凋亡与免疫功能抑制密切相关，抑制免疫细胞凋亡能有助于改善机体免疫功能，进而提高生存率［4］。范震等［5］的研究结果显示microRNAs（miRNAs）参与脓毒症的发病过程。有研究结果表明，microRNA-29a（miR-29a）参与肿瘤细胞凋亡的调控，而

2、关于miR-29a对免疫细胞状态的影响及其机制的研究，目前仍缺乏报道。本研究采用内毒素脂多糖（LPS）诱导人单核细胞株THP-1，模拟脓毒症免疫细胞炎症反应过程，并通过细胞转染的方法，将miR-29a的拟似物（mimic）或抑制剂（inhibitor）导入细胞内，上调或下调细胞内miR-29a的表达水平，进而观察细胞凋亡水平的变化并探讨其相关分子机制，为阐明miRNAs在脓毒症中的作用及寻找脓毒症干预的新靶向提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　人单核细胞系（THP-1）细胞株和人胚肾细胞株293T（购自上海细胞库）。内毒素（

3、LPS）（购自美国Sigma公司）；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇（购自美国GIBCO公司）；LipofectamineRNAiMAX、Lipofectamine2000、Trizol、SYBRGreenqPCR试剂盒均购自Invitrogen公司；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（购自南京凯基生物公司）；报告基因活性检测试剂盒（Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem，Promega）；pGL3-control-MCS和Renil

4、laluciferase质粒（Invitrogen公司），内切酶和连接酶（美国Fermentas公司），质粒提取试剂盒（美国Omega）。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及传代方法将THP-1细胞置于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5％CO2培养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，细胞含量控制在1106/ml，每2d换液一次，每4d传代一次。细胞复苏后，传至3～5代后用于实验。细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞贴壁融合率达到80%时进行转染。　　1.2.2实验分组将

5、按1.2.1项操作所得THP-1细胞分为正常对照组（CON组）、LPS组（加入LPS1μg/ml诱导细胞，相应CON组用PBS代替LPS，诱导24h后收集细胞检测）、miR-29a拟似物转染组（简称miR-29amimic组，转染48h后收集细胞检测），miR-29a拟似物转染对照组（negativecontrol组，简称NC组，转染48h后收集细胞检测），miR-29a抑制剂转染组（简称miR-29ainhibitor组，转染48h后收集细胞检测）。　　1.2.3寡核苷酸序列设计与合成miR-29a的拟似物（mimic）根据其成

6、熟体序列（miRBaseaccessionNo.MI0000087）合成。miR-29a的抑制剂则采用miR-29a成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行2-甲氧修饰（由吉玛公司设计）。双链RNA的负对照（NC）为与哺乳动物基因组没有同源性的序列，该序列的设计和所有核苷酸的合成均由上海吉玛公司完成。所有PCR引物均由上海英骏生物公司合成（表1）。　　1.2.4载体构建Bcl-2和Mcl-13UTR报告基因载体pGL3-BCL2-3UTR-CL1-3UTR-utation，Mut）。所有载体均以pGL3-control-MCS为基础，在

7、ApaI和XbaI的酶切位点间插入野生型或突变型的Bcl-2和Mcl-13UTR序列获得的。野生型插入片段的模板是BCL2基因（NM_000633）和MCL1基因（NM_021960）的3UTR。突变型插入片段的模板是以野生型载体为基础，在PCR扩增使用的引物上引入突变位点，在分别扩增突变位点上下游两段序列后，通过融合PCR及酶切产生［6］。　　1.2.5细胞转染和报告基因活性检测miRNA的单独转染采用转染试剂LipofectamineRNAiMAX。以6孔板为例，THP-1细胞更换新鲜的RPMI1640培养基（不含FBS和抗生素）每

8、孔2ml。将miRNA稀释于200μlOpti-MEM培养基中；每管加入8μlLipofectamineRNAiMAX，轻柔混匀，室温放置15min；将RNAiMAX与siRNA的稀释液加入6孔