脂多糖肽聚糖诱导人血小板凋亡的体外研究

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1、分类号：R558+.2学校代码：10062密级：学号：2012602445硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：脂多糖/肽聚糖诱导人血小板凋亡的体外研究TITLEResearchofPlateletApoptosisInducedbyLipopolysaccharide/PeptidoglycanonHumaninvitro一级学科：临床医学二级学科：急诊医学论文作者：王淑娟指导教师：王勇强天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R558+.2学校代码：10062密级：学号：2012602445学位类别：科学学位专业学位☑学

2、科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：脂多糖/肽聚糖诱导人血小板凋亡的体外研究TITLEResearchofPlateletApoptosisInducedbyLipopolysaccharide/PeptidoglycanonHumaninvitro一级学科：临床医学二级学科：急诊医学论文作者：王淑娟指导教师：王勇强导师组成员：王勇强王兵天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文

3、中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中

4、文摘要研究目的本研究拟通过制备人的洗涤血小板，并在TLR4/TLR2单克隆抗体阻断前后分别给予LPS/PGN刺激，初步探讨体外条件下LPS/PGN对血小板凋亡的诱导效应及LPS-TLR4、PGN-TLR2通路在其中发挥的作用，为脓毒症相关性血小板减少症的发病机制提供基础研究证据，为改善脓毒症相关性血小板减少症患者的预后提供可能的治疗靶点。内容第一部分：体外条件下，LPS诱导人血小板凋亡的研究及TLR4的介导作用制备人洗涤血小板，浓度梯度组用不同浓度的LPS分别与洗涤血小板进行体外孵育，观察LPS对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的LPS最适浓

5、度。TLR4单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照，观察TLR4单克隆抗体阻断前后，LPS对血小板凋亡诱导作用的变化。第二部分：体外条件下，PGN诱导人血小板凋亡的研究及TLR2的介导作用制备人洗涤血小板，浓度梯度组用不同浓度的PGN分别与洗涤血小板进行体外孵育，观察PGN对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的PGN最适浓度。TLR2单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照，观察TLR2单克隆抗体阻断前后，PGN对血小板凋亡诱导作用的变化。方法制备洗涤血小板，建立体外反应体系，分别设置LPS/PGN浓度梯度实验组及TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验组，

6、以凝血酶诱导的血小板凋亡作为阳性对照，应用流式细胞技术测定不同处理组血小板的PS外翻及ΔΨ去极化，应用凋亡蛋白抗体芯片法筛查血小板凋亡相关蛋白的表达水平，应用蛋白印记技术检测促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果LPS及PGN均以浓度依赖性为特点诱导血小板发生PS外翻及ΔΨ去极化。凋亡蛋白抗体芯片结果显示，在LPS及PGN刺激下，血小板多种凋亡相关蛋白的表达发生变化，主要以促凋亡蛋白的升高及抗凋亡蛋白的降低为主。WesternIBlot结果提示LPS及PGN诱导下，血小板促凋亡蛋白Caspase-3、-

7、8、Bax及Bak的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达也呈增高趋势。而TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验表明，LPS-TLR4/PGN-TLR2通路至少部分介导了LPS/PGN诱导的血小板凋亡的发生。结论1.LPS及PGN均可诱导血小板发生凋亡，表现为PS外翻、ΔΨm去极化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、Bak、Bax及Bcl-2等凋亡相关蛋白表达增高；2.内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径均参与了LPS/PGN诱导的血小板凋亡；3.TLR4参与了LPS诱导的血小板凋亡的发生，TLR4单克隆抗体至少可以部分阻断LPS诱导的血小板

8、凋亡；TLR2参与了PGN诱导的血小板凋亡的发生，TLR2单克隆抗体至少可以部分阻断PGN诱导