结节性硬化症基因新突变鉴定

《结节性硬化症基因新突变鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、结节性硬化症基因新突变鉴定结节性硬化症(tuberoussclerosisplex，TSC)是一种常染色体显性遗传病，以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为特征，最易累及脑部、皮肤、和肾脏。该疾病具有遗传异质性，致病基因包扩TSC1(MIM605284)和TSC2(MIM191092)。TSC1基因定位于9q34.13，编码含1164个氨基酸、分子量为130kD的蛋白产物，称为错构瘤蛋白(hamartin)。TSC2基因定位于16p13.3，编码1807个氨基酸、分子量为200kD的蛋白产物，称为马铃薯球蛋白(tutberin)。Tuberin与hamart

2、in蛋白在胞内形成复合物，该复合物通过tuberin蛋白调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mTOR)信号转导通路从而调控细胞的生长和增殖。或基因突变均TSC1TSC2可导致tuberin与hamartin复合体功能缺陷，mTOR信号通路异常激活，从而导致结节性硬化症的发生。根据人类基因突变数据库专业版的统计，截止至2015年4月，该数据库共记录了TSC1基因突变303种，TSC2基因突变969种。TSC1和TSC2突变类型均以碱基置换导致的错义和无义突变为主，TSC2基因易发生大片段的缺失及基因重组，但这在TSC1基因较为罕见。无论是散发病例还是家系患者，

3、致病突变多见于TSC2基因。此外，两种基因无明显的突变热点区域，突变广泛分布于编码区。本研究采用PCR和DNA测序的方法对一例中国汉族结节性硬化症家系的先证者进行TSC2和TSC1基因的突变检测，旨在对该家系进行致病突变筛查和进一步确定诊断，并为TSC致病机制的研究提供依据。　　1　材料和方法　　1.1研究对象　　我们收集了1个中国汉族结节性硬化症家系中先证者的外周静脉血样，该患者18岁，女，7-8岁发病，具有面部血管纤维瘤和癫痫症状，为家族遗传性，先证者父亲也为受累患者，未能收集到其他临床资料。患者均签署知情同意书。　　1.2基因组DNA提取　　取患者I

4、II-1枸橼酸钠抗凝处理的外周静脉血250μl，选用UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(TaKaRa)试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存。　　1.3PCR扩增致病基因及测序分析　　在UCSCX站获得TSC1及TSC2基因的DNA序列，使用PrimerPremier5.0软件设计覆盖该基因编码区(包括外显子和内含子交界区)的引物，引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成。其中扩增TSC2基因外显子15的引物序列为：上游5'-GAATACCGACTGCCATTTCT-3'，下游5'

5、-AGGTGGGAGTGTGAAGAATG-3'。首先对先证者III-1进行检测，PCR扩增该患者TSC2和TSC1基因的全部外显子，PCR反应2+体系为2GCBufferI(MgPlus)25μl，dNTPMixture(各2.5mmol/L)8μl，上下游引物终浓度为0.5μmol/L，TaKaRaLATaq2.5U，基因组DNA约100ng，加ddHO至50μl。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳2150解剖科学进展2016年第22卷第2期Fig1.PedigreeofTSCfamily检测，切胶纯化后对PCR产物进

6、行Sanger测序分析。利用UCSC数据库Blat功能对测得的DNA序列进行比对分析。　　1.4核酸限制性内切酶检测验证　　对未报道的新突变c.1556C>T，在患者及120名无关正常个体中进行酶切验证，以排除多态性。采用错配引物方法，使突变的个体引入限制性内切酶的酶切位点。用错配引物对先证者及120名正常个体进行扩增，PCR产物经过限制性内切酶酶切消化过夜，酶切产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。　　1.5片段克隆测序　　由于未获得先证者双亲外周血样本，为鉴定先证者样品中的两个突变是分别继承自父母双方，还是均来自先证者的受累父亲，利用TaKaRa

7、AgaroseGelDNAPurificationKit，对先证者的TSC1第15外显子PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，取150ul菌液均匀涂布于氨苄青霉素-LB平板培养基，37℃过夜培养，利用载体通用引物M13-47和TSC1基因外显子15的下游引物进行菌落PCR，阳性克隆扩增培养后，送博迈德生物技术有限公司进行测序。　　2　结果　　2.1DNA测序结果　　DNA测序结果显示先证者TSC1基因第15外显子有两个位点突变，第一个突变是错义突变c.1556C>T，该突变导致第

8、519位氨基酸由苏氨酸变成异亮氨酸(p.Thr519Ile)，检索