胃癌患者外周血survivin基因mrna表达及

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1、胃癌患者外周血Survivin基因mRNA表达及【摘要】目的检测胃癌患者外周血中肿瘤细胞Survivin基因mRNA表达，探讨其在胃癌微转移检测中的意义。方法采用逆转录分子信标实时荧光定量PCR（RT-QPCR）方法，以Survivin基因cDNA克隆重组质粒为标准品，检测胃癌患者外周血肿瘤细胞中Survivin基因mRNA模板拷贝数，分析拷贝数与临床资料之间的关系。结果Survivin基因mRNA分子信标实时定量方法的线性检测范围为104～109个拷贝，外周血肿瘤细胞Survivin基因模板拷贝数与患者的性别、年龄、TNM分期及病理类型差异无显著性（P＞0.05），而与患

2、者淋巴结转移及生存状况差异有显著性（P<0.05）。结论外周血肿瘤细胞Survivin基因mRNA表达可用于检测胃癌的血性转移，为早期诊断微转移的存在、评价患者预后、指导临床治疗提供依据。【关键词】定量PCR；survivin；微转移；外周血；胃癌ExpressionofsurvivinmRNAinperipheralbloodofpatientsplication【Abstract】ObjectiveTostudythemRNAexpressionofsurvivingeneinperipheralbloodofpatientserasechainreaction(

3、RT-QPCR)usingamolecularbeaconprobe，idcontainingthesequenceofsurvivinRNAdidnotcorrelatephnodemetastasisandpoorsurvival(P<0.05).ConclusionTheexpressionofsurvivinmRNAcanbeusedtodetectemicro-metastasisinperipheralbloodcirculationofgastriccancer.Itisausefulmarkertopredictprognosisanddecideon

4、clicinaltherapy.【Keyicrometastasis；peripheralblood；gastriccarcinoma胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗中，复发和转移是常见的问题，直接影响到患者的预后。早期发现肿瘤患者外周血中是否有肿瘤细胞存在，不仅对判断肿瘤转移和复发有着重要的价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要的意义。随着逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术的广泛应用，可以检测到肿瘤患者外周血中常规方法（如CT、MRI、普通形态学及免疫组织化学等）无法检测到的极少数肿瘤细胞中特异基因mRNA的表达，预示肿瘤的微小转移存在。近来，特别是荧光

5、实时定量PCR技术的发展，不仅可以定量检测mRNA的原始模板拷贝数，而且由于特异性探针的引入，使其灵敏度也高于常规PCR的定性检测。Survivin是1997年［1］发现的凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosis，IAP）家族成员之一，它在终末分化的成人正常细胞中很少表达，而在绝大多数肿瘤细胞中高表达［2，3］。文献报道［4～6］，胃癌患者中Survivin基因mRNA表达阳性率高达60%以上，使其很有可能成为一个潜在的胃癌肿瘤标志物。本文采用逆转录分子信标实时荧光定量PCR（RT-QPCR）技术，选择Survivin基因作为胃癌微转移的研究靶点，定量检测胃癌

6、患者外周血中Survivin基因mRNA的模板拷贝数，探讨其在胃癌微转移中的意义。1材料与方法1.1材料1.1.1标本收集本院2001年11月～2003年11月手术切除经病理证实的胃癌患者56例，其中男34例，女22例；年龄38～86岁，中位年龄56岁；TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期13例；组织学类型：低分化腺癌16例，乳头状/管状腺癌11例，黏液癌14例，混合性癌15例；按生存期分组：30个月内无转移复发者30例，为生存组；30个月有转移复发或死亡者26例，为转移死亡组。1.1.2探针及引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物：5’-CCTG

7、GCAGCCCTTTCTCA-3’，下游引物：5’-TCAGTGGGGCAGTGGATG-3’，分子信标探针：5’-CCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCATGCGG-3’（画线部分为探针自身互补序列），探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团DABCYL；扩增片段大小121bp。1.2方法1.2.1总RNA提取术前取患者静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，淋巴细胞分离液（灏洋公司产品）分离有核细胞，生理盐水洗涤3次，于-80℃冰箱保存。采用Trizol（Invitrogen公司产品）试剂提取细胞总