可溶性endoglin与子痫前期发病关系的研究

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可溶性Endoglin与子痫前期发病关系的研究蒋玉蓉张丽娟【摘要】目的探讨可溶性endoglin(SolubleendoglinsEng)与子痫前期发病的关系。方法(1)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定30例子痫前期患者(子痫前期组)分娩前及分娩后血清sEng水平，其中轻度子痫前期14例，重度子痫前期16例。并以30例健康孕妇作为对照(对照组)，测定其早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠血清sEng水平。(2)采用蛋白印迹法（WesternBlot)检测各组孕妇胎盘组织中sEng蛋白的表达水平。结果（1）sEng在正常早、中、晚孕组血清中表达水平分别为1.21±0.23ng/ml、1.78±0.28ng/ml、2.85±0.38ng/ml，中孕组和晚孕组高于早孕组，差异有统计学意义(P<0.05)，晚孕组高于中孕组，差异有统计学意义(P<0.05)。（2）正常妊娠产后组sEng水平(2.06±0.30ng/ml)均较晚期妊娠妇女减低，差异有显著性(P<0.01)。（3）sEng在子痫前期为6.17±1.41ng/ml，与对照组晚期妊娠妇女比较，差异均有显著性(P<0.01)。子痫前期重度组（7.33±0.77ng/ml）高于子痫前期轻度组（4.86±0.51ng/ml），差异均有统计学意义(P<0.01)。（4）子痫前期产后组sEng水平(2.19±0.29ng/ml)与正常妊娠产后组比较差异无统计学意义(P>0.05)。（5）妊娠34周前发病子痫前期患者血清sEng水平分别为7.96±0.64ng/ml，较妊娠34周后发病的子痫前期患者血清sEng水平(6.82±0.37ng/ml)明显升高(P<0.01)。（6）sEng蛋白在重度子痫前期组、轻度子痫组胎盘组织中的表达为0.60±0.14、0.32±0.11，明显高于对照组晚期妊娠妇女0.16±0.02，差异有统计学意义(P<0.01)，且子痫前期组重度患者高于子痫前期组轻度患者(P<0.01)。（7）对照组血清sEng水平与胎盘sEng蛋白表达水平有相关性(r=0.523；P<0.05);子痫前期组血清sEng水平与胎盘sEng蛋白表达水平也有相关性(r=0.836；P<0.01)。结论（1）子痫前期患者血清中sEng水平升高并与其病情严重程度相关。（2）子痫前期患者通过胎盘组织中胎盘sEng蛋白过度表达，引起血循环中sEng水平升高，参与子痫前期的病理生理过程。【关键词】子痫前期；endoglin；可溶性endoglin；蛋白印迹作者单位：410011，长沙，中南大学湘雅二医院妇产科通讯作者：张丽娟，Email:zlj621116@yahoo.com.cn ThestudyoftherelationshipbetweenthesolubleendoglinandpreeclampsiaJIANGYu-rongZHANGLi-juan,DepartmentofGynecologyandObstetrics，XiangyaSecondHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410011，ChinaCorrespondingauthor:ZHANGLi-juan,E-mail:zlj621116@yahoo.com.cn【Abstract】Objective:Toinvestigatetherelationshipbewteensolubleendoglin(sEng)andpreeclampsia.Methods:ThelevelsofsEnginseurmof30womenwithpreeclampsia(includingmildpreeclampsia14cases,severepreeclampsia16cases)and30nomralPrengnatwomen(includingfirsttrimesterpregnancy,2ndtrimesterpregnancy,and3rdtrimesterpregnancy)weredetectedbyenzymelinkedimmuosorbentassay.WesternblotwasusedtoinvestigatetheexpressionofsEnginplacentasofthesewomen.Results:(1)TheseurmlevelofsEngofthethirdtrimesterpregnancy(2.85±0.38ng/ml)washigherthanthatofthefirsttimestergroup(1.21±0.23ng/ml；P<0.01)andthatofthesecondtrimestergroup(1.78±0.28ng/ml；P<0.01).(2)TheseurmlevelsofsEngofthenormalposptartumgroup(2.06±0.30ng/ml)werelowerthanthoseofthethirdtrimestergroup((P<0.01).(3)TheseurmlevelofsEngofpreeclampsia（6.17±1.41ng/ml）weresingificantlyhigherthanthatofthethridtrimestergroup(P<0.01).TheseurmlevelofsEngoftheseverepreeclampsia(7.33±0.77ng/ml)weresingificantlyhigherthanthatofthemildpreeclampsia（4.86±0.51ng/ml）(P<0.01).(4)TheseurmlevelsofsEngofthepreeelampsiapostpartumgroup（2.19±0.29ng/ml）hadnosingnificantdifferencecompaerdwiththatofthenormalpostpartumgroup(P>0.05).(5)TheseurmlevelsofsEngofthepreeclampsiawomenwiththeonsetbeofer34gestationweeks(7.96±0.64ng/ml)andweresingnificantlyhigherthanthatofthewomenwiththeonsetatfer34gestationweeks（6.82±0.37ng/ml)(P<0.01).(6)TheproteinexpressionofsEngwassingificantlyhigherinseverepreeclmapsiagroup(0.60±0.14)andmildpreeclmapsiagroup(0.32±0.11)comparedwiththethirdtrimestergorup(0.16±0.02;p<0.01),andtheseverepreeclmapsiawashigherthanthemildgroup(p<0.01).(7)TherewassingnificantcorrelationbetweenthelevelofsEnginseurmandtheprotein expressionofsEnginplacentaofnomralprengancygroup(r=0.523；P<0.05)andpreeclampsiagoups(r=0.836；P<0.01).Conclusion:(1)Theseurmlevelofthepreeclampsiagoupwashigherthanthenormalpregnancygroupandcorrelatedwiththeseverityofthedesease.(2)ExcessexpressionofsEnginplacentamayinducehigherlevelofsEnginserum,whichmaybeinvolvedinthepathophysiologicalprocessofpreeclampsia.【Keywords】preeclampsia;endoglin;solubleendoglin;westernblot子痫前期是以高血压、蛋白尿为主要临床表现的妊娠期特有的疾病。该病严重影响母儿的健康，是孕产妇发病及死亡的主要病因之一。尽管子痫前期的病因及发病机制尚未阐明，但较多学者认为子痫前期的发病与胎盘滋养细胞浅着床引起子宫胎盘缺血缺氧有关。可溶性Endoglin（sEng）是转化生长因子β（TGF-β）亚型的可溶性受体，具有血管生成抑制作用。为探讨子痫前期胎盘组织及外周血中sEng的表达及在子痫前期病理生理过程中的意义，我们对子痫前期患者胎盘组织及外周血sEng的表达水平进行了检测，现将结果报道如下。1资料与方法1.1研究对象选择2008年5月～12月在中南大学湘雅二医院产科收治的子痫前期的患者30例，其中轻度子痫前期患者14例，平均孕周(38.12±1.56)周，重度子痫前期患者16例，其中早发型重度子痫前期患者7例，平均孕周(32.12±1.65)周，晚发型重度子痫前期患者9例，平均孕周(37.47±2.14)周。子痫前期的诊断标准参照参照《妇产科学》(第7版)，将发病于34周前的称为早发型重度子痫前期,在此之后的称为晚发型重度子痫前期。另选同期在本院门诊及住院的足月妊娠孕妇20例为对照组,在其早期妊娠(10～12+6周)、中期妊娠（25～27+6周）、晚期妊娠（33～42周）采集血标本。两组孕妇平均年龄（29±3岁），均为单胎，均为剖宫产，既往均无高血压、心脏病、急慢性肾炎、糖尿病、甲亢、免疫系统疾病、传染病病史，无输血史。1.2方法1.2.1标本采集子痫前期组病人在住院后未经硫酸镁及其他药物治疗前抽取肘静脉血3ml，对照组在妊娠早、中、晚期均于清晨空腹抽取肘静脉血3ml，两组妇女分娩48小时后再次采集肘静脉血，分离血清后置-70℃下保存备用； 两组孕妇在剖宫产胎盘娩出后，立即在无菌状态下在胎盘母体面中央取一块胎盘组织1cm×1cm×1cm大小，放入无菌Eppendorff管，10分钟内置于液氮中保存，待蛋白印迹(westernblot)检测。1.2.2酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清sEng水平：采用ELISA法分别测定子痫前期组、子痫前期各个亚组及正常妊娠组早期、中期、晚期血清sEng和水平,试剂盒由美国ADL公司提供,操作按试剂盒说明书进行。所有标本均行复孔检测且为同批测定,均值为最终浓度,批内变异<5%。1.2.3Westernblot技术检测胎盘sEng表达水平：（1）总蛋白的提取。（2）制胶。（3）SDS-PAGE电泳。（4）转膜。（5）免疫反应。(6)化学发光。以GAPDH为内参照。Westernblot结果对条带进行灰度值扫描,获得与内参照的灰度值比值。试剂盒由美国R&D公司提供，操作按试剂盒说明书进行。1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件,对两样本均数比较用两独立样本的t检验，两因素相关分析用Pearson相关分析。2结果2.1各组血清sEng水平比较结果见表1。对照组中期妊娠妇女sEng水平与早期妊娠妇女妊娠妇女比较，明显升高(t=8.572;P<0.01);晚期妊娠妇女sEng水平与中期妊娠妇女相比差别有统计学意义(t=12.476；P<0.01);正常妊娠产后组sEng水平均比晚期妊娠组下降，两者比较差异有显著性(t=9.279;P<0.01);子痫前期组sEng水平与对照组晚期妊娠妇女相比，差别有统计学意义(t=12.32;P<0.01)，其中重度子痫前期组与轻度子痫前期组相比，差别有统计学意义(t=10.24;P<0.01);子痫前期产后组sEng水平与正常妊娠产后组比较差异无统计学意义(t=1.698；P>0.05)。—表1各组血清sEng水平分析（X±S）组别例数sEng((ng/ml)对照组早期妊娠301.21±0.23中期妊娠301.78±0.28晚期妊娠302.85±0.38正常妊娠产后组302.06±0.30 子痫前期组306.17±1.41轻度子痫前期组144.86±0.51重度子痫前期组167.33±0.77子痫前期产后组302.19±0.292.2母血sEng水平与子痫前期发病时间的关系7例早发型重度子痫前期患者血清sEng水平7.96±0.64ng/ml,9例晚发型重度子痫前期组患者血清sEng水平6.82±0.37ng/ml，早发型重度子痫前期患者血清sEng水平明显高于晚发型重度子痫前期组，差异有统计学意义（P<0.01）。2.3各组胎盘组织sEng蛋白的表达，见图1。←Eng90kD←sEng65kDmarker123456←GAPDH37kDmarker图1各组孕妇胎盘组织sEng蛋白Westernblot的检测结果1和2对照组胎盘组织3和4轻度子痫前期胎盘组织5和6重度子痫前期胎盘组织sEng在重度子痫前期、轻度子痫前期及对照组胎盘的表达分别为0.60±0.14、0.32±0.11、0.16±0.02。轻度子痫前期组与对照组胎盘比较，差异有显著性（t=6.375；P<0.01),重度子痫前期组与轻度子痫前期组比较，差异有显著性(t=6.212；P<0.01)。2.4血清sEng水平与胎盘组织sEng蛋白的水平的相关性分析正常妊娠组血清sEng水平与胎盘组织sEng蛋白的表达水平呈正相关（r=0.523；P<0.05）；子痫前期组血清sEng水平与胎盘组织sEng蛋白的表达水平也呈正相关（r=0.836；P<0.01）。 3讨论子痫前期以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿、水肿为主要特征,因其临床症状在分娩后可迅速消失，提示胎盘来源的循环因子在子痫前期中可能起着关键作用。目前普遍认为，子痫前期的发病是由于早期妊娠时胎盘血管重铸障碍，胎盘缺血缺氧,诱发胎盘释放一系列因子进入母体循环,引起母体广泛的内皮功能紊乱，终末器官缺血及血管通透性增加，引发高血压和蛋白尿等临床症状。Endoglin（Eng）又名CD105，是分子量为180KD的同型二聚体膜糖蛋白，主要表达于新生血管内皮细胞及胎盘合体滋养细胞表面。Eng是转化生长因子（TGF-β1）和（TGF-β3）亚型的细胞表面复合受体，是内皮细胞增殖的相关标记物。TGF-β可调节血管生成和血管壁结构的完整性，并且在生长发育、细胞生长等过程中起重要作用。Eng与TGF-β结合后介导其信号转导，发挥调节血管生成和eNOS的表达及活性、抗凋亡等作用。可溶性Endoglin（solubleendoglin）分子量为65KD，是Eng的可溶形式，可能是通过蛋白水解的过程从全长Eng蛋白的N末端分解产生，并进入母体循环。sEng抑制TGF-β1与内皮细胞上Eng受体的正常结合,与TGF-β1结合形成sEng—TGF-β1复合物，但不能转录TGF-β1的信号，因此阻断的TGF-β1生物效应，干扰内皮细胞的增殖和毛细血管的形成，增加毛细血管通透性；并通过抑制TGF-β调节的eNOS活性来调控血管紧张度，从而引起血管生成障碍及内皮损伤。本文研究结果显示，正常妊娠血清sEng水平早孕组低于中孕组和晚孕组，中孕组低于晚孕组，提示sEng随妊娠进展逐渐升高，可能参与维持妊娠的全过程。同时，子痫前期患者血清sEng水平明显高于正常晚期妊娠，而重度子痫前期患者明显高于轻度患者，提示血清sEng水平与子痫前期发病密切相关。StaffAC等发现在子痫前期患者血浆及羊水中sEng浓度明显高于正常孕妇，而脐血中sEng浓度无明显差异，进一步说明sEng是一种胎盘来源的循环因子。本研究还发现妊娠34周以前发病的子痫前期患者血清sEng水平较34周以后发病的晚发型重度子痫前期患者升高更为明显，提示胎盘sEng表达水平与子痫前期病情的发展及严重程度密切相关。本研究结果显示，子痫前期患者胎盘sEng蛋白表达水平明显高于正常孕妇，重度子痫前期患者明显高于轻度子痫前期患者。正常妊娠与子痫前期患者胎盘 sEng表达量与血清sEng水平有明显的相关性。且分娩后血清sEng迅速下降，也证实了胎盘是血清中sEng的重要来源之一。子痫前期的发病起源于胎盘的病理生理改变，子宫螺旋动脉重铸障碍是子痫前期发病的中心环节。子宫螺旋动脉重铸开始于妊娠6～8周,妊娠4～6个月发生广泛的血管重铸。CaniggiaI等发现Eng能短暂地抑制绒毛外滋养细胞的分化，在孕5-8周绒毛培养物中加用Eng的单克隆抗体或反义寡链核苷酸能明显刺激滋养细胞的生长和迁徙。sEng阻断TGF-β1的信号转导使血管内皮功能障碍。因此，Eng、sEng不适当的上调可能导致滋养层侵蚀不足，子宫螺旋动脉重铸障碍，胎盘血管生成减少，胎盘缺氧，进一步加重血管内皮功能障碍，引起小动脉痉挛，血管通透性增加，最终导致妊娠期高血压疾病的发生。而GuY发现低氧条件(2%)下较常氧环境（20%）培养绒毛组织Eng、sEng含量明显升高，说明低氧能上调Eng、sEng的表达，而子痫前期患者的胎盘存在缺血缺氧，这提示子痫前期时循环中过多的sEng亦可能是胎盘缺血缺氧条件下的继发产物。Levine指出循环中的sEng在子痫前期症状出现前2-3月即出现升高，有望作为预测子痫前期的生物标记，有助于进行疾病早期筛查，以降低子痫前期的发病率。恢复血管生成因子和抗血管生成因子的平衡为治疗子痫前期提供了一种新的思路。总之，子痫前期患者通过胎盘sEng蛋白过度表达，引起循环中sEng升高，阻断TGF-β的促血管生成作用及血管舒张作用，参与子痫前期的病理生理过程。参考文献