二肽基肽酶iv抑制剂体外筛选模型的建立及应用

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1、http://www.paper.edu.cn二肽基肽酶IV抑制剂体外筛选模型的建立及应用1苗雷1，许泓瑜1，许正宏1,2*1江南大学医药学院制药工程实验室，江苏无锡（214122）2江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡（214122）E-mail:smartml@163.com摘要:目的建立二肽基肽酶IV抑制剂的筛选模型。方法采用DPPIV活性测定方法,以 Gly-Pro-PNA为反应底物，通过测得产物PNA量来检测DPPIV的活性，对酶量、底物浓度、 最佳温度、pH及反应时间进行了优化。结果当酶量为0.5U·L-1、底物浓度为0.262µmol·L-1、 温度37℃、p

2、H8.2时可获最大酶活性，并进一步对323种中药进行了筛选，水蛭、茯神、 密蒙花等中药提取物具有DPPIV抑制作用。结论此方法有效、可行，可作为DPPIV抑制 剂的筛选模型，用来筛选以DPPIV为靶点的降糖药物。关键词:二肽基肽酶IV，抑制剂，比色法1引言二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV,DPPIV;EC3.4.14.5/CD26)是位于细胞表面的一种丝氨酸肽酶(serinepeptidase)，由Hopsu-Havu和Glenner在鼠肝脏组织匀浆过程中发现的,广泛存在于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中,其催化活性中心位于胞外分子C末端区域,凡N末端

3、数第二位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是该酶发挥活性的主要底物[1]。胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞——L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖素,在体内具有抑制血糖升高作用[2],但因为GLP-1的N末端两个氨基酸为His-Ala,易被DPPⅣ降解而失去活性,所以体内极短的半衰期限制了其临床上的直接应用[3]。DPPIV抑制剂能有效延长GLP-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度，国外已有此类化学合成药物上市，如默克公司的西他列汀和诺华公司的维格列汀，还有许多已进入三期四期临床阶段，相比以上合成

4、药物从天然药物中筛选DPPIV抑制剂有许多优点，除了毒性低，生理条件下更为稳定外，还有望为合成新药提供更多的化学结构，因此建立一种可对天然药物进行DPPIV抑制剂筛选的模型具有理论和实际意义。发现高效、特异性好、以DPPIV为靶点的降糖药物，首先需要建立快速、灵敏、可靠、方便的药物筛选模型。目前国际上筛选DPPIV抑制剂的方法主要有以带荧光基团（AMC/AFC）的Gly-Pro-AMC/AFC为底物的荧光底物法和以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物的发色底物法。前者通过荧光分光光度计测定荧光值高低来确定酶活。这一方法相对可靠，快速，灵敏度高，但成本、技术和仪器要求

5、均比较高，不适合国内普通实验室开展大规模药物筛选，而后者源于NagatsuT,HinoM,FuyamadaH等人在1976年建立了一种以Gly-Pro-PNA作为底物检测体内X-prolyldipeptidy-aminopeptidase活性的方法，该方法建立的反应体系为75µmol·L-1glycyne-NaOH缓冲液、1.5µmol·L-1X-Y-p-nitroanilide、酶、纯水，总体积为1.05ml[4]。之后以Gly-Pro-PNA作为底物检测DPPIV活性的比色法开始广泛被应用，在国外被应用于从海洋生物中、化学合成药物以及组合化学合成的DPPIV抑制剂中筛选DPPIV

6、抑制剂等。国内尚无此类药物的研究报道。本研究的目的在于，综合前人经验基础上建立反应体系更微量、反应时间更简短的比色法，方法操作简便、仪器简单，并将之用于对323种中药的筛选。该方法的检测原理为在碱性条件下DPPIV1本课题得到国家“863”重点项目（2007AA021506）；教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-07-0380）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn催化底物Gly-Pro-PNA水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在波长405nm处有特征性吸收峰，通过酶标仪在405nm处测得的吸光度大小即发色基团PNA生成量多少反映酶活性高低。2材

7、料与方法2.1材料2.1.1药品DPPIV及IIe-Pro-IIe购于sigma公司，甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺购于浙江夸克公司，中药粉末购于三九医药。2.1.2仪器SPECTRAmaxPLUS384型连续光谱酶标仪（美国）；PHS-3TC型精密数显pH计（上海天达仪器有限公司）。2.2方法2.2.1DPPIV活性测定及反应条件的优化DPPIV酶活测定方法参考文献[5,6,7]并略加修改。实验分为4组，每组重复3次，分别为阴性对照组（酶+缓冲液+底物），空白对