白藜芦醇对人外周血单核-巨噬细胞ccr5表达的影响

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　　白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CCR5表达的影响【摘要】目的：观察白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CC型趋化因子受体5(CCR5)表达的调节作用。方法：采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞。采用IFN-γ（1×105U/L)诱导单核/巨噬细胞表达CCR5，再分别加入不同浓度的白藜芦醇(0.5，5，25，50和100μmol/L)进行干预。培养24h后收集细胞，RT-PCR法检测外周血单核/巨噬细胞CCR5mRNA表达水平；流式检测单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率。同时将CCR5荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5）转染各组细胞，检测各转染组的荧光素酶相对活性。结果：中、高浓度白藜芦醇处理组（25,50和100μmol/L）的CCR5mRNA表达水平、CCR5阳性细胞率和CCR5-luc报告基因的荧光素酶相对活性比对照组均有所降低，低浓度白藜芦醇处理（0.5和5μmol/L）对单核/巨噬细胞CCR5的表达无明显影响。结论：中、高浓度白藜芦醇可抑制外周血单核/巨噬细胞CCR5的表达。【关键词】白藜芦醇；单核/巨噬细胞；巨噬细胞移动抑制因子；报告基因；趋化因子受体　　［Abstract］Objective:Tostudyregulating effortsofresveratrolontheexpressionofCC-chemokinereceptor-5(CCR5)inhumanperipheralmonocyte/macrophage.Methods：MononuclearcellshumanperipheralbloodbythemethodofFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.MacrophagesediumtoinducethecellsexpressingCCR5.DifferentconcentrationofRES(0.5，5,25,50and100μmol/L)etime.Monocyte/macrophageRNAetry.CCR5reportgeneentionedabove,therelativeluciferaseactivityofCR5reportgeneol/L）treatedgroupparedol/Ltreatedgroup.Conclusion：MidstandhighconcentrationofresveratrolhavetheeffortstoinhibittheexpressionofCCR5inhumanperipheralmonocyte/macrophage.　　［Keyonocyte；macrophage；CCR5；reportgene;chemokinereceptor　　白藜芦醇(Resveratrol,RES,3,5,4′ -三羟基-均二苯代乙烯)是一种主要由葡萄属植物产生的成分，具有广泛的药理功能，如抗菌消炎、诱导肿瘤细胞凋亡、清除自由基、抗氧化、抗衰老、保肝、保护心血管、内分泌调节和免疫调节等［1］。2004年Krishnan等［2］首先报道了白藜芦醇的抗HIV-1作用，发现白藜芦醇可诱导处于感染潜伏期的HIV-1基因表达病毒抗原，从而刺激机体免疫系统的抗病毒作用［2］。2006年杨子峰等［3］利用感染HIV的小鼠模型证实了白藜芦醇的抗HIV作用。目前白藜芦醇的抗HIV作用越来越引起了人们的重视，但是对于白藜芦醇的抗HIV机制尚不清楚。众所周知CC型趋化因子受体5（CC-chemokinereceptor-5,CCR5）在HIV-1病毒感染单核/巨噬细胞的过程中起到了非常重要的作用，CCR5与HIV-1的gp120结合后可以促进HIV-1病毒进入细胞，有很多抗HIV-1药物的靶位点正是CCR5［4］，我们推测白藜芦醇可能是通过下调单核/巨噬细胞CCR5的表达，从而起到抗HIV-1病毒作用。若果真如此,这将对揭示白藜芦醇的抗病毒机制起到非常重要的作用，也将为白藜芦醇抗HIV-1的药用价值提供重要的基础理论依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　健康人外周血（新乡医学院第一附属医院）；白藜芦醇(Sigma)；DMSO(Sigma)；IFN-γ（Sigma）；淋巴细胞分离液（上海生工）；lipofectamine2000Reagent(Promega) ；RES-荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5，含有CCR5启动子-416bp～+61bp)由日本Nagasaki大学Moriuchi博士惠赠；pGL3-Basic(Promega）；pGL3-Control(Promega)；荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa）；FITC-鼠抗人CD14单抗(PharMingen)；FITC-羊抗鼠IgG(PharMingen)；鼠抗人CCR5抗体(PharMingen)　　1.2方法　　1.2.1人外周血T细胞的分离取健康人外周血5ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，转入塑料培养皿,于37℃孵育6h,轻轻晃动培养皿,PBS洗涤3次，弃去上清，黏附在培养皿上的细胞即为单核/巨噬细胞。用EDTA法重悬细胞，锥虫蓝染色法测定收获细胞的活力，以>95%为合格［5］。以FITC-鼠抗人CD14单抗染色细胞，流式检测单核/巨噬细胞的纯度，以>90%为合格［6］。　　1.2.2白藜芦醇干预将上述细胞密度调整为2×106L-1，加入24孔板，1ml/孔，然后加入IFN-γ(终浓度1×105U/L［5］)，同时分别加入终浓度为0.5，5，25，50和100μmol/L的白藜芦醇，并设不加白藜芦醇的对照组(白藜芦醇用DMSO溶解，各组DMSO终浓度不超过0.2%)［7,8］，置于37℃、体积分数为0.05CO2培养。　　1.2.3RT-PCR法检查CCR5基因的表达 细胞总RNA的提取：于细胞培养24小时收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤1次，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取5μlRNA进行琼脂糖电泳。　　CCR5及内参照GAPDH的合成：CCR5(482bp)正义引物5′-GTGGGCAACATGCTGGTCAT-3′，反义引物5′-GGCAGGACCAGCCCCAAGAT-3′；GAPDH(639bp)正义引物5′-AGCTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，反义引物5′-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3′。　　RT-PCR法检查CCR5基因的表达:按逆转录试剂盒（TaKaRa）说明书进行。取样本RNA3μg，分别加入50μmol/LOligo(dt)1μg，0.1μmol/LDTT1μl，40U/μlRNAaseOUT1μl，10mmol/LdNTP1μl、逆转录酶MMLV1μl，加RNAase-freeH2O至25μl。PCR反应体系为：模板cDNA1.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，10mmol／LdNTP2μl，10μmol／L引物各1μl及TaqDNA聚合酶0.5μl，加水至25μl；于96℃变性5min，96℃30s，55℃30s，72℃30s，共计25个循环；72℃延伸10min。取10μlPCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测。　　1.2.4各组单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率检测 于细胞培养24h后，收集细胞，用PBS（含0.2%BSA和0.02%叠氮化纳）洗涤２次，弃上清，分别加入鼠抗人CCR5抗体（2.5μg/ml），同时作同型对照，置4℃30min。用2.5μg/ml的FITC-羊抗鼠IgG洗涤并重悬细胞，置4℃30min。PBS洗涤后用300目滤网过滤，然后分别上机应用流式细胞仪检测［9］。　　1.2.5CCR5荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5）转染试验①质粒DNA的纯化：将质粒pGL3-Basic-CCR5，pGL3-Basic，pGL3-Control和pSVβ-gal,分别转化细菌，获得转化菌，用质粒大量提取试剂盒按产品说明书提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA纯度（无RNA带为合格），用蛋白核酸分析仪检测质粒DNA含量及纯度［D(260nm)/D(280nm)>1.8为合格］。②质粒DNA瞬时转染单核/巨噬细胞，按照lipofectamine2000Reagent(Promega)产品说明书进行操作。方法为细胞转染次日，EDTA法重悬对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640换液，调整细胞密度为2×105L-1，加入24孔板中，1ml/孔。细胞转染前以不完全RPMI1640洗涤每孔2次，每孔加入不含抗生素的完全RPMI16401ml，置于37℃，5%CO2培养备用。取质粒pGL3-Basic-CCR5，pGL3-Basic（阴性对照组）和pGL3-Control（阳性对照组）各1μg分别混入0.2μgpSVβ -gal（内参照），分别加入50μl不完全RPMI1640培养基，分别取脂质体2μl加入50μl不完全RPMI1640培养基，置室温5min，缓慢混合DNA及脂质体稀释液，室温孵育20min，随后将DNA-脂质体稀释液按照100μl/孔加入24孔板，轻轻前后晃动培养板使液体混匀，置于37℃，5%CO2培养。③药物干预：转染5h后各转染组加入IFN-γ(终浓度1×105U/L)，其中pGL3-Basic-CCR5转染组再加入终浓度为0，0.5，5，25，50和100μmol/L的白藜芦醇，置于37℃、体积分数为5%CO2继续培养。④荧光素酶相对活性测定：于转染48h后收集细胞转入1.5mlEP管，1000r/min离心5min,弃上清，PBS洗涤2次，每管加入200μl报告基因细胞裂解液，振荡30s，置室温5min，12000r/min离心30s，取20μl上清液加入100μl荧光素混合后立即用荧光分析仪检测光密度值。用β-galELISA检测试剂盒及酶标仪检测各组β-半乳糖苷酶活性（D值）。⑤荧光素酶相对活性的计算方法：荧光酶活性校正值＝荧光素酶光密度值/β-galD值，荧光素酶相对活性=各组荧光酶活性校正值/pGL3-Basic转染组校正值。　　1.2.6统计学处理样本PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带的灰度分析采用BandLeaderApplicationVersion3.00软件；数据以x± s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，差异显著性用单因素方差分析(One-：标准，为100,200,300,400,500和600bp。RT-PCR产物中MIF扩增产物带为482bp，GAPDH扩增产物带为630bp，各孔上样量为5μl。　　图11.5%琼脂糖凝胶电泳检测CCR5RT-PCR产物（略）　　Fig1RT-PCRproductstestedby1.5%agarosegelelectrophoresis　　A:对照组nbsp;B：RES0.5μmol/L组C：RES5μmol/L组　　D:RES25μmol/L组E：RES50μmol/L组F：RES100μmol/L组　　图2单核/巨噬细胞表面CCR5流式检测图（略）　　Fig2LevelsofCCR5onmonocyte/macrophagetestedbyfloetry　　2.2各组单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率　　对照组、白藜芦醇0.5,5,25,50和100μmol/L组CCR5阳性细胞率（%）分别为76.3±16.8,78.1±17.1,75.7±16.4,66.2±15.0,62.5±14.7和58.9±15.3(图2）。低浓度白藜芦醇（0.5和5μ mol/L）处理组CCR5阳性细胞率与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。中、高浓度白藜芦醇（25,50和100μmol/L）处理组CCR5阳性细胞率较对照组显著降低（P<0.05），各组CCR5阳性细胞率均值分别比对照组下降了13%,18%和23%（P<0.05）。　　2.3CCR5荧光素酶报告基因转染荧光素酶相对活性　　低浓度白藜芦醇（0.5和5μmol/L）处理组荧光素酶相对活性与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。中、高浓度白藜芦醇（25,50和100μmol/L）处理组荧光素酶相对活性较对照组显著降低（P<0.05），各组荧光素酶相对活性均值分别为对照组的0.84,0.81和0.76倍（P<0.05），见图3。　　荧光素酶相对活性　　图3各报告基因转染组荧光素酶相对活性（略）　　Fig3Resultsofrelativeluciferaseactivityofeachtransfectedgroup　　3讨论　　CCR5是与G蛋白偶联的7次跨膜蛋白，全长包括352个氨基酸，主要表达在单核/巨噬细胞和T细胞表面。CCR5与其主要配体MIP-1,MIP-1β和RANTES结合后, 可激活膜内G蛋白，并引起胞内Ca2+浓度上升及蛋白激酶C的活化，从而表现出白细胞的趋化性及炎症反应等各种生理功能［10］。CCR5还是HIV-1感染单核/巨噬细胞的重要辅助受体。HIV-1首先通过包膜蛋白gp120与单核/巨噬细胞表达的CD4分子结合，随后又与细胞表面的CCR5结合，这种结合诱发gp41插入胞膜，进而病毒进入细胞内［11］。CCR5对于HIV-1感染单核/巨噬细胞是必须的，例如CCR5△32的基因突变个体可抵抗HIV-1的感染，还有很多抗HIV药物的作用机制就是改变CCR5的构象，阻止其与gp120的结合，如TAK-779,SCH-C和E-913等药物［12］。因此单核/巨噬细胞CCR5的表达水平与其对HIV-1的易感染程度是密切相关的。 　　本实验的结果提示在体外实验中，中、高剂量的白藜芦醇能明显下调单核/巨噬细胞表达CCR5，而CCR5的表达水平又与HIV-1的感染密切相关，因此白藜芦醇抑制单核/巨噬细胞CCR5的表达很可能是其抗HIV-1的机制之一。在HIV-1感染的早期，HIV-1感染的靶细胞主要是单核/巨噬细胞，其后才是CD4+T细胞，所以白藜芦醇在HIV-1早期感染中可能会起到较为明显的作用。另外单核/巨噬细胞还可通过CCR5，接受趋化因子的信号向炎症部位聚集，从而发挥炎症作用，例如2型糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病，与趋化因子和CCR5所介导的单核/巨噬细胞浸润是密切相关的［13,14］。因此白藜芦醇抑制单核/巨噬细胞CCR5表达的作用，可能也是其具有抗炎作用的机制之一。　　单核/巨噬细胞CCR5的表达受很多细胞因子的调节，如一定剂量的IL-2,IL-10,PHA,LPS或IFN-γ可上调CCR5的表达，西罗莫司等则可抑制其表达［5,15］。因为未经刺激的人外周血单核/巨噬细胞的CCR5表达水平较低（仅为3%～25%）,难以反映白藜芦醇的抑制作用，因此在本实验中采用IFN-γ（1×105U/L）刺激单核/巨噬细胞表达CCR5,使CCR5细胞阳性率达到了75%以上。本实验CCR5报告基因测定结果显示，中、高浓度白藜芦醇（25,50和100μmol/L）处理组荧光素酶相对活性较对照组显著降低（P<0.05），其荧光素酶相对活性均值分别为对照组的0.76～0.84倍（P<0.05）。这提示中、高浓度的白藜芦醇能够在体外下调单核/巨噬细胞内CCR5启动子的活性，抑制CCR5基因的表达。在CCR5的调控序列中含有Oct-1,TCF-1和GATA1等顺式作用元件，有研究 认为细胞因子主要是通过STAT-3-c-Jun/c-Fos途径来引起CCR5启动子的活化［16］。白藜芦醇有可能通过抑制其中某些信号蛋白的活化，起到抑制CCR5转录的作用，具体机制还有待进一步研究。需要指出的是白藜芦醇在体内可形成多种代谢产物如葡萄糖醛酸等［17］，这决定了白藜芦醇在体内的药理作用要比体外实验更为复杂，因此白藜芦醇的抗HIV或抗炎作用可能是多种机制共同作用的结果。该领域的研究还需要更多的体内实验支持，相信随着研究的深入，白藜芦醇在临床将得到更广泛的应用。【参考