白花蛇舌草对膀胱癌ej细胞株的增殖抑制作用及其机制

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1、白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制作者：李雨成王赞滔龙志新刘景汉【摘要】目的研究白花蛇舌草的提取物体外抑制膀胱癌EJ细胞株增殖的作用及其机制。方法体外培养膀胱癌EJ细胞株，不同浓度的白花蛇舌草提取物作用12～72h，通过MTT法检测细胞生长的抑制作用，采用荧光标记的方法检测端粒酶含量。结果随着实验组白花蛇舌草提取物浓度的增加和作用时间的延长EJ细胞的生长抑制率也逐渐增加，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。流式细胞仪分析表明，在培养72h后和对照组相比，实验组端粒酶的数目随着药物浓度的增高而明显减少并且呈现浓度依赖性。结论白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞的增殖有显著的抑制

2、作用，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。端粒酶在药物作用后数量的变化很可能成为白花蛇舌草抑制膀胱癌EJ细胞生长的机制。【关键词】膀胱癌；端粒酶；白花蛇舌草第一作者：李雨成(1967)，男，硕士，副教授，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病的研究。目前膀胱癌的主要治疗方法是以手术为主并配合术后化疗，常用的局部化疗药物主要为噻替派、丝裂霉素、阿霉素，局部免疫治疗药物为卡介苗、干扰素。从中药中筛选抗肿瘤药物为目前肿瘤药物治疗的一个热点。白花蛇舌草对许多株肿瘤细胞的增殖抑制作用已有报道〔1～4〕，但对膀胱癌EJ细胞株的作用尚不清楚。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1白花蛇舌草的乙

3、醇提取物〔1，2〕　　中药白花蛇舌草为购自本市中医院中药房的生药，取干燥生草1kg完全浸泡在水中1.5h,分别煮1.5、1.0、0.5h，水煎后抽滤提取，并收集提取液3次，将3次提取液合并浓缩，并加入乙酸乙酯脱脂(1∶2)，取水相液加6倍乙醇(预冷)。水相液静置24h后抽滤5次得深咖啡色粗多糖，并溶于二蒸水，用针式滤器抽滤后加入10%的RPMI1640完全培养基置于4℃冰箱待用。　　1.1.2细胞来源　　人膀胱移行细胞癌EJ细胞株(上海午立生物有限公司)。　　1.1.3实验试剂　　RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、荧光标记山羊抗兔IgG(FITC)(华美生物工程有限公司)

4、，兔抗人TERT单克隆抗体(美国SantaCruz公司，北京中杉生物有限公司代理)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为Sigma公司)。　　1.1.4主要设备　　超净工作台(江苏省无锡市净化技术研究所华达净化设备厂)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，恒温培养箱(美国INK公司)，台式低温离心机(Sigma公司)，流式细胞仪(美国B.D公司)，旋转蒸发仪(上海机械制造厂)。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　人膀胱癌EJ细胞株。培养基为RPMI1640，内含10%的胎牛血清及10万U/L的庆大霉素，在37℃，5%CO2孵箱中培养，每3～4d换液传代维持适当的细胞密度，0

5、.25%胰蛋白酶消化细胞。　　1.2.2实验分组　　对照组不加白花蛇舌草提取物加一抗和二抗，每天更换RPMI1640培养液。实验组加白花蛇舌草提取物浓度分别为0.5、1.0、1.2、1.5μg/L。接种细胞24h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。空白组(MTT法不设空白组)不加白花蛇舌草提取物，加等量的PBS(pH7.4)代替一抗和二抗。　　1.2.3细胞毒性分析　　用MTT比色法测定不同浓度白花蛇舌草提取物对EJ细胞增殖的影响并绘制剂量效应曲线。将细胞数为2×104/ml呈对数生长期的EJ细胞接种于96孔培养板中，于37℃含5%CO2孵箱中培养24h，进入对数

6、生长期后，将细胞分成实验组、对照组，实验组加不同浓度中药制剂，每个浓度设5个复孔；对照组加肿瘤细胞不加任何药物，为阴性对照。分别培养12、24、48、72h后每孔加入MTT溶液20μl,作用4h后弃上清，每孔加入二甲基甲砜100μl，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。　　1.2.4端粒酶的定量检测〔3，4〕　　将对照组、实验组和空白组共同培养72h。用0.25%的胰蛋白酶消化后收集数量不少于1×106/ml细胞于1mlEp管中，共30个。4℃缓冲液离心洗2次(去上清)。4%多聚甲醛1ml悬起细胞，室温孵育10min，4℃缓冲液洗1次(去上清)。加

7、甲醇1ml/1×106/ml悬起细胞，室温孵育10min。4℃缓冲液洗1次(去上清)。用0.2%TristonX1001ml悬起细胞，PBS洗后4℃离心(去上清)。对照组、实验组加鼠抗人hTERT单克隆抗体(1∶200)稀释液100μl混匀室温孵育30min，4℃缓冲液洗1次(去上清)，空白组加等量的PBS。对照组、实验组加荧光标记的二抗山羊抗兔IgG(1∶200)稀释液100μl悬起细胞,室温避光孵育30min，用4℃缓冲液离心洗1次(去上