大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

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1、大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验作者：姚天华，李晓红，熊曦州，饶国洲，石建峰，李昂【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；骨向分化；钛网；组织工程　　摘要：目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系，进行骨向分化诱导，并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用

2、密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系，MSCs能够向成骨细胞分化，骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。　　关键词：骨髓间充质干细胞；细胞培养；骨向分化；钛网；组织工程　　Anexperimentalstudyofosteogenicdifferentiationand　inductedinvitroofSDratbonemarrocell　　

3、ABSTRACT:ObjectiveToestablishanisolationandculturesystemofratbonemarrocells(MSCs),osteogenicdifferentiationandpoundtitaniummeshesinvitroinordertoverifythEirosteogenesis.MethodsDensitygradientcentrifugationSDratsandthEIrmorphologicalcharacteristicsinedunder

4、microscope.TheboneMSCsundericalandimmunocytochemicalstainingedtoverifytheirmultipotential.Cellsofosteogenicdifferentiationthatpoundedtitaniummeshesicroscope.ResultsHighpurityofboneMSCsineraliztionnodestainingmeshesicroscope,itatrix.ConclusionTheisolationan

5、dculturesystemofratboneMSCsmeshesatrix.　　KEYSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞类型，不但能增殖，在特定培养条件下还能实现跨系统分化。大量实验表明在体外可分化为成骨细胞、成软骨细胞等组织细胞[1]。由于其取材方便，易于体外分离培养扩增，且自体获取回输后不会发生免疫排斥反应，基因转染效率高，转染后稳定表达，因此骨髓MSCs被认为是组织工程和基因工程的重要种子细胞。本研究在总结以往研究的基础上，紧密结合临床，探索有关骨髓MSCs诱导分化为成骨细胞和钛网复合成

6、骨细胞体外成骨，旨在探讨成骨细胞钛网移植物成骨的可行性。　　1材料与方法　　1.1主要材料及实验仪器SD大鼠(西安交通大学医学院动物实验中心)、LG(低糖)DMEM培养液(GIBCO)、胎牛血清(FBS)(GIBCO)、地塞米松(GIBCO)、β甘油磷酸钠(GIBCO)、抗坏血酸(GIBCO)、胰蛋白酶(1∶300)(GIBCO)、1.077×103g/L淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、商用纯钛网(西北有色金属研究所)、JSM840型扫描电镜(西安交通大学医学院电镜室)。　　1.2骨髓MSCs体

7、外分离和培养取4周龄SD大鼠，无菌条件下取出胫骨和股骨，剪去骨骺端，用LGDMEM培养液冲出骨髓，离心收集细胞。将细胞制成细胞悬液，加入含等量淋巴细胞分离液的试管中，以800g×30min离心，吸取界面白膜层细胞，培养液清洗，1.0×108/L接种于培养瓶中，37℃，50mL/LCO2的培养箱内培养。4d后更换培养液，以后每周换液2次。10-14d后待细胞达到70%-80%融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，传代。　　1.3骨髓MSCs诱导取第三代骨髓MSCs，按5×107/L的细胞密度制备细胞爬片，培养

8、3d贴壁后进行诱导。骨向诱导液为含10%(体积分数)FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，1×10-7mol/L地塞米松，10mmol/Lβ甘油磷酸钠，50μg/L抗坏血酸的LGDMEM培养液。每4d换液一次，共诱导2周。　　1.4鉴定碱性磷酸酶(ALP)染色：采用钙钴法ALP染色。分别选取骨向诱导1、2周的骨髓MSCs爬片，PBS洗涤后进行染色，显微镜下观察照相，黑染细胞为阳性细胞。以未诱导的细胞