楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验

《楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验作者：何海斌，朱庆银，陈强，林茹，李清禄【摘要】目的从药用植物楮头红中分离纯化多糖成分并验证其生物活性。方法用热水提取，乙醇沉淀提取粗多糖，再经Sevag法去除蛋白，透析去除小分子物质，冷冻干燥得楮头红多糖粗品；采用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-200凝胶柱层析进行分离纯化；用TBA法考察多糖的抗脂质过氧化作用；采用CCl4急性肝损伤模型，测定其血清中AST变化。结论获得一个楮头红多糖组分。TBA法表明该组分对小鼠自发性脂质过氧化具有显著的抑制

2、作用；在保肝试验中，给药组能明显抑制AST的升高，对肝损伤有一定的保护作用。【关键词】楮头红多糖；分离；纯化；生物活性crudeproductofS.nepalensisatography.Theinhibiteffectofthepolysaccharideonlipidperoxidationofmiceliverethod.Themodelofliver-injuryinducedbycarbontetrachloride（CCl4)arkablyinhibitlipidperoxidat

3、ionofratliverandsignificantlyreduceactivityofAST.【Keyan）、sephadexG-200填料（Pharmacia）、透析袋（3500）、联苯双酯滴丸（北京协和药厂）；石油醚（沸程60～90℃）、95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、98%浓硫酸、氯仿、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇等，均为分析纯。1.3楮头红粗多糖的提取1.3.1楮头红多糖的提取［4，5］楮头红全草用蒸馏水洗涤去土，40℃低温干燥、粉碎。称取草药250g,用石油醚80℃回流脱脂2次，之后

4、用95%乙醇除小分子单糖，滤渣挥去酒精，晾干后于90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，离心去除不溶物。滤液加0.1%的活性炭60℃保温30min，不断搅拌脱色，过滤，取上清液放入-40℃冰箱过夜，第二天取出自然融化后离心（5000r/min）去除不溶物。上清液浓缩适当的体积后缓缓加入5倍量的95%乙醇沉淀，过滤，沉淀依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复3次。1.3.2除蛋白［9］用Sevag法脱蛋白，氯仿正丁醇4：1，多糖溶液和混合液的体积比为3：1，混合搅拌20～30min，充

5、分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀。1.3.3透析干燥多糖复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比为1：20，4h换一次水。将透析液进行冷冻干燥后即得粗多糖。1.4楮头红粗多糖的纯化分离［6～13］1.4.1DEAE-52柱层析DEAE-52填料依次用0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、0.5mol/LNaOH处理（每次30min），再以蒸馏水洗至中性后装柱（柱尺寸为40cm×2.5cm）。装柱后用蒸馏水平衡48h。将粗多糖溶于少量重蒸水（5～

6、8mg/ml），过柱，上样量为交换容量的10%～20%。用水、0.1mol/LNaCl、0.5mol/LNaCl梯度洗脱，用自动部分收集器每15min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测各主峰组分，将各主峰位分别收集合并，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得楮头红多糖。1.4.2SephadexG-200柱层析将SephadexG-200填料加适量蒸馏水浸泡12h，100℃煮沸4h，脱气后装柱，用0.05mol/LNaCl平衡48h。将1.4.1中收集的各主峰组分进一步纯化，用0.05mol/LNaC

7、I洗脱，自动部分收集器每30min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测。收集各主峰组分，冷冻干燥。1.4.3HPLC纯度验证将多糖溶解成合适浓度，过0.45μm的滤膜后进样，进样体积20μl，流速1.0ml/min，示差检测器检测（检测器温度35℃），柱温箱温度35℃。1.5多糖的生物活性验证1.5.1小鼠肝自发性脂质过氧化实验［14］小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的0.01mol/LPBS（pH为7.4）洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10%的肝匀浆

8、。取该匀浆1ml，加不同浓度的多糖溶液600ul，对照管不加样品，用PBS作空白，于37℃温育2h，加入20%三氯乙酸1ml终止反应，3500r/min离心10min，取上清液2ml加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）1ml，90℃水浴15min，取出后流水冷却。于532nm处测A值，以不加肝匀浆和样液为比色空白样（A0），以加肝匀浆不加样品为对照样（Ai），按下式计算脂质过氧化物（LPO）的清除率：LPO的清除率（%）=（A0-Ai）/A0×1001.5.2多糖保肝活性试验［15］取50只健康