大鼠海马神经元中μ阿片受体、cck受体的表达及慢性吗啡作用对其表达的影响

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　　大鼠海马神经元中μ阿片受体、CCK受体的表达及慢性吗啡作用对其表达的影响【摘要】目的:研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海马神经元的分布和吗啡对其受体的影响.方法：用激光共聚焦扫描技术，以神经元特异性标记抗体NF200对原代海马神经元进行鉴定，采用特异性的MOR1，CCKAR，CCKBR的抗体观察观察它们在海马神经元上的表达.选用雄性OR1，CCKAR及CCKBR；给予吗啡后2~4d，MOR1在海马神经元上的表达较对照增高(P<0.05)，5d时，MOR1的表达显著下降(P<0.01)；随吗啡作用时间延长，CCKAR和CCKBR在海马神经元的表达呈上调趋势，且CCKBR的表达高于CCKAR(P<0.01).结论：海马神经元上同时存在MOR1，CCKAR和CCKBR，吗啡作用时间越长，MOR1表达越弱，而CCKAR和CCKBR表达越强.【关键词】阿片受体；CCKA受体；CCKB受体；吗啡依赖；原代海马神经元；激光共聚焦；流式细胞术　　0引言　　研究表明μ受体（MOR1）是吗啡等阿片类物质的主要作用位点，镇痛活性最强，成瘾性也最强［1-2］. 另有实验研究表明：在中枢神经系统中广泛分布着一种典型的脑肠肽－胆囊收缩素(cholecystokininoctapeptide,CCK)，它是脑内含量最高的一种神经肽［3］，其通过CCK受体发挥生理作用.实验已证实：CCK受体拮抗剂不但能针对戒断症状进行对症治疗，而且有一定程度的防止复吸作用［4］，但具体机制尚未完全阐明.本研究采用不同的实验技术，重点阐明MOR1,CCKAR及CCKBR是否存在于海马神经元上以及吗啡在不同的时间点对3种受体的影响，为进一步研究CCK受体拮抗剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响及其机制的研究奠定必要的基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　健康雄性OR)，沈阳第一制药厂生产，批号：辽宁药准字(1996)第002747号.DMEM培养基、NeurobasalMedium，B27(美国Gibco公司)；山羊抗CCKA，山羊抗CCKB抗体，兔抗MOR1多克隆抗体，FITCdonkeyantimouseIgG，BiotindonkeyantirabbitIgG(美国SantaCruz公司)；TRITCrabbitantigoatIgG，FITCrabbitantigoatIgG，FITCgoatantirabbitIgG(北京中山生物公司)；CY5antirabbitIgG(Camical公司)；小鼠抗NF200单克隆抗体(NEO MARKERS公司)；兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；激光共聚焦显微镜(德国LEica)；EpicsXL流式细胞仪(美国BeckmanCoulter).　　1.2方法　　1.2.1原代大鼠海马神经元培养　　取出生1d的大鼠在无菌条件下分离海马组织，制备细胞悬液，用含B27Supplement的NBM进行原代海马神经元培养.　　1.2.2神经元鉴定　　取培养6d的大鼠海马神经元，用免疫荧光标记技术进行鉴定，一抗分别为GFAP多克隆抗体和NF200单隆抗体，二抗分别为BiotindonkeyantirabbitIgG＋CY5antidonkeyIgG和FITCdonkeyantimouseIgG，标记后选择不同视野细胞进行激光共聚焦扫描40ｘ（激发波长488nm，发射波长530nm）.　　1.2.3MOR1，CCKAR，CCKBR在海马神经元的表达　　将原代海马神经元随机分为NF200/MOR1，NF200/CCKAR，NF200/CCKBR3组，特异性抗体同上，用免疫荧光标记和激光共聚焦扫描技术检测受体的表达.　　1.2.4MOR1，CCKAR，CCKBR在吗啡处理大鼠海马神经元的表达 　　1.2.4.1给药与分组　　60只健康雄性1～M9组（分别给予MOR1~9d），大鼠参照　　2.2MOR1,CCKAR及CCKBR在海马神经元的表达　　在海马神经元膜，轴突和树突上均有发蓝色荧光的MOR1阳性表达产物（图2A，D）；绿色荧光标记物与红色荧光标记物重叠之后呈橙黄色荧光，CCKA,CCKB受体呈橙黄色标记,在海马神经元膜表面广泛分布（图2B，C，E，F）.　　2.3吗啡对大鼠海马神经元MOR1,CCKAR,CCKBR表达的影响　　采用流式细胞技术检测给予吗啡后MOR1，CCKAR，CCKBR在海马神经元上的表达.给予吗啡2d时MOR1上调(P<0.05)，5d时MOR1开始出现下调，蛋白表达量显著下降(P<0.01)，并呈时间依赖性.给药2d，CCKB受体的荧光强度值较对照组相比显著升高(P<0.05).给药5d，CCKA受体的荧光强度值较对照组显著升高(P<0.01，表1).同一时间点CCKB受体的荧光值高于CCKA受体(P<0.01，表1).表1吗啡对大鼠海马神经元MOR1,CCKB和CCKA受体表达的影响(略)　　3讨论 　　阿片类物质长期作用会引起细胞的一些适应性改变，如阿片受体下调、内吞以及环磷酸腺苷(cAMP)信号转导系统的上调等，可能与阿片耐受和依赖的形成有关［7］.μ受体介导了吗啡的身体依赖性和精神依赖性［8］.在吗啡依赖状态下，海马、纹状体、丘脑、下丘脑的μ受体特异性结合密度发生非常显著下降［9-10］.本实验选择海马为靶区，模拟自然吗啡依赖形成过程，来观察μ受体的变化.结果显示μ受体（MOR1）存在于海马神经元的细胞膜、轴突及树突膜上.这与已有的研究结果类似［11］，其机制可能是由于受体磷酸化和去磷酸化反应之间的失衡所致μ受体基因表达下降或膜上μ受体发生内吞.CCK是脑内含量最高的一种神经肽［12］，其作用与阿片受体拮抗剂不同，它不是直接阻断阿片受体，而是激活CCK受体，使阿片受体的结构和功能发生变化，与阿片的结合力降低.该研究说明CCK受体与阿片受体直接对话.连续注射吗啡6d，使大鼠多数脑区CCK8含量升高，CCKmRNA含量显著增高［13］.Blandine等［14］证实，CCKB受体的缺失可以导致内源性阿片肽的增量调节.CCK8可能参与吗啡依赖的形成.但不同时间点吗啡对大鼠海马神经元CCK受体的影响报道甚少，为此我们通过LSCM观察了CCKA和CCKB受体在海马神经元上的表达，并应用流式细胞技术检测吗啡作用下CCKA和CCK B受体在不同时间点的蛋白表达.证实CCKA，CCKB受体广泛存在于神经元的细胞膜、轴突及树突膜上，而且表达量很高.且海马神经元以CCKB受体为主.CCK8作为很强的内源性抗阿片肽，在阿片介导的疼痛、耐受及成瘾中起到了非常重要的作用.CCK受体可与阿片受体直接作用或通过受体后机制相互影响.但μ阿片受体与CCK受体之间存在何种相关性有待于进一步研究.【参考