干扰flt3基因表达对急性骨髓系白血病细胞活性的影响

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1、干扰FLT3基因表达对急性骨髓系白血病细胞活性的影响[]目的利用RNAi技术干扰FLT3基因，研究其对髓系白血病细胞（HL-60）活性的影响，进而探讨利用RNAi技术靶向治疗急性骨髓系白血病(AML)的可能性。方法以NC(HL-60细胞)和HK(含shRNA-FLT3的阴性对照的HL-60细胞)、F1(实验组，含shRNA-FLT3的HL-60细胞本实验室已实验证明对FLT3有干扰作用)3种细胞株为研究对象。实验分2组，每组皆包括NC、HK和F13种细胞株：1)药物组：LY294002(PI3K通道阻断剂)作用组。2)对照组：未加LY294002。MTT和流式细胞术(FCM)分别测定细胞

2、活性和细胞凋亡率的变化。结果1)药物组、对照组组内比较：以NC做参照，F1能使细胞活性下降，细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义(P0.05)。2)药物组与对照组组间相比，药物组的细胞活性下降，细胞凋亡率增加，差异均有统计学意义(P0.05)；②药物组和对照组组间：NC()和NC(-)、HK()和HK(-)、F1()和F1(-)，药物组吸光值的表达均低于对照组，差异有统计学意义(P0.05)，见表1。　　　　2.2药物组和对照组细胞凋亡的变化FCM检测细胞凋亡:①对照组和药物组组内：F1凋亡率的表达均高于NC、HK(P0.05)；②药物组和对照组组间：NC()和NC(-)、HK()和HK(

3、-)、F1()和F1(-)，药物组凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P0.05)，见表2。　　　　3讨论在我国，白血病是十大高发的恶性肿瘤之一。尽管现在有化疗，手术治疗等多种方法来治疗白血病，但其病死率仍居高不下。化学疗法仍是现在治疗白血病的主要手段，但其巨大的毒副作用常常使患者不能忍受，也严重的影响着人们的生活质量，骨髓移植因其配型的困难以及高额的医疗费用，成为其治疗白血病的最大缺点。FLT3是急性髓系白血病(AML)治疗的理想靶向基因[4]，目前已研发了几种FLT3小分子抑制剂，SU5416/11248、MLN518、CEP701、CT53518等，但由于FLT3与其它RTK受体

4、同源，FLT3抑制剂往往和KIT、VEGF-R2、PDGF-R，蛋白激酶C等也有高度亲和性，用于治疗时副作用不可避免[4-5]。RNA干扰技术是FLT3靶向抑制的另一选择，它可只抑制FLT3的表达，而对其它RTK无影响；再者若FLT3靶向RNAi与其它分子靶标联合治疗时，其抑制效果互不干扰[6-7]，这对AML这种多基突变疾病的治疗十分重要。研究发现：FLT3的异常表达可导致下游信号持续激活[8]，导致细胞非控制性增殖。RNA干扰技术用shRNA-FLT3靶向抑制FLT3的表达，而对其它RTK无影响而倍受人关注。但shRNA-FLT3的信号途径至今仍不明确，进一步阐明shRNA-FLT3

5、与其它分子相互作用的机制以及FLT3异常激活引发的下游信号传导是RNAi分子抑制策略成功的关键。　　本实验中，药物组和对照组组间，药物组细胞活力的表达均低于对照组；凋亡率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，这说明了LY294002可以抑制HL-60细胞活性，从而促进细胞凋亡。　　AML是一组涉及多种转录因子和信号分子(特别是酪氨酸激酶)的遗传性改变，具有多步骤发病的特点，因此多靶点、联合治疗是AML治疗的关键[9]。在本实验中，F1()是siRNA和LY294002联用的结果，F1(-)、NC()分别是siRNA和LY294002单独作用的结果。F1()、F1(-)、NC()与

6、NC(-)差异显著（P<0.05），F1()与F1(-)，F1()与NC()之间，也存在显著差异（P<0.05）。这表明了shRNA-FLT3、LY294002单独作用均可引起HL-60细胞凋亡，抑制细胞增殖，LY294002对FLT3-shRNAi的促进细胞凋亡有协同增效作用，且最佳作用时间在24-48小时之间。　　综上：1)siRNA干扰HL-60细胞FLT3基因表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。2)LY294002可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；3)FLT3-shRNAi与LY294002联合作用可更有效地抑制细胞活性，促进细胞凋亡。这为RNAi以及RNAi联合治疗白血病提供了理论

7、依据。