溶菌酶晶体培养试验

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1、溶菌酶晶体培养实验一．实验目的近年来，X射线晶体结构分析技术在受体研究中得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养实验：1．了解蛋白质分子结晶的原理2．了解影响蛋白质分子结晶的因素3．掌握蛋白质晶体的悬滴培养法二．蛋白质分子结晶的原理蛋白质结晶的4个主要步骤：1．测定蛋白质溶液的纯度1．蛋白质溶液与盐，有机化合物等沉淀剂混匀；膜蛋白需要加入去垢剂2．混合溶液达到过饱和状态，形成晶核3．晶核一旦形成，晶体开始生长三．影响蛋白质分子结晶的因素1．待结晶蛋白质的纯度，一般要求纯度高于95%2．待结晶蛋白质的浓度，5~10mg/ml3

2、．沉淀剂，盐，PEG，有机溶剂4．pH值5．温度，4°C,16°C6.结晶方法，悬滴法，坐滴法7．震动四．试剂及器材1．试剂：溶菌酶蛋白，氯化钠，醋酸钠，去离子水2．器材：可调移液器，晶体培养板，硅化盖玻片，真空脂，晶体培养箱，显微镜五．试验步骤1．配制50mg/ml溶菌酶溶液，0.1M醋酸钠溶液，pH4.52．配制池液：（1）5%(w/v)氯化钠，0.1M醋酸钠溶液，pH4.5（2）8%(w/v)氯化钠，0.1M醋酸钠溶液，pH4.53．在晶体培养板溶剂池中分别加入0.3ml池液（1）和池液（2）4．在干净的硅化盖玻片上，滴加2ml溶菌酶溶液和2ml池液5．

3、将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池上，用真空脂密封6．将晶体培养板放入16°C晶体培养箱7．第二天，在显微镜下观察晶体生长情况ProcedureforCrystallizationofLysozymeChemicalsneeded:LysozymeproteinSodiumChlorideSodiumAcetatebufferDistilledwaterProcedure1.Prepare50mg/mlsampleoflysozymein0.1MNaAcpH4.52.Preparewellsolutions:a.5%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacet

4、ate,pH4.5b.8%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacetate,pH4.53.Place0.3mlofwellsolutiona,wellsolutionbineachwellofaVDXtray4.Onacleansilatedcoverslide,create4dropsof2μllysozymesolution,2μlwellsolution5.Sealthesecoverslipswithgreaseoverawell6.PlacetheVDXplatein16°Cincubator.7.Observethecrystalsnextd

5、ayundermicroscope