溶菌酶的晶体培养试验

溶菌酶的晶体培养试验

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1、溶菌酶晶体培养实验一.实验目的近年来,X射线晶体结构分析技术在受体研究中得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养实验:1.了解蛋白质分子结晶的原理2.了解影响蛋白质分子结晶的因素3.掌握蛋白质晶体的悬滴培养法二.蛋白质分子结晶的原理蛋白质结晶的4个主要步骤:1.测定蛋白质溶液的纯度1.蛋白质溶液与盐,有机化合物等沉淀剂混匀;膜蛋白需要加入去垢剂2.混合溶液达到过饱和状态,形成晶核3.晶核一旦形成,晶体开始生长三.影响蛋白质分子结晶的因素1.待结晶蛋白质的纯度,一般要求纯度高于95%2.待结晶蛋白质的浓度,5

2、~10mg/ml3.沉淀剂,盐,PEG,有机溶剂4.pH值5.温度,4°C,16°C6.结晶方法,悬滴法,坐滴法7.震动四.试剂及器材1.试剂:溶菌酶蛋白,氯化钠,醋酸钠,去离子水2.器材:可调移液器,晶体培养板,硅化盖玻片,真空脂,晶体培养箱,显微镜五.试验步骤1.配制50mg/ml溶菌酶溶液,0.1M醋酸钠溶液,pH4.52.配制池液:(1)5%(w/v)氯化钠,0.1M醋酸钠溶液,pH4.5(2)8%(w/v)氯化钠,0.1M醋酸钠溶液,pH4.53.在晶体培养板溶剂池中分别加入0.3ml池液(1)和池液(2)4.在干净的硅化盖玻片上,

3、滴加2ml溶菌酶溶液和2ml池液5.将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池上,用真空脂密封6.将晶体培养板放入16°C晶体培养箱7.第二天,在显微镜下观察晶体生长情况ProcedureforCrystallizationofLysozymeChemicalsneeded:LysozymeproteinSodiumChlorideSodiumAcetatebufferDistilledwaterProcedure1.Prepare50mg/mlsampleoflysozymein0.1MNaAcpH4.52.Preparewellsolutions:a

4、.5%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacetate,pH4.5b.8%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacetate,pH4.53.Place0.3mlofwellsolutiona,wellsolutionbineachwellofaVDXtray4.Onacleansilatedcoverslide,create4dropsof2μllysozymesolution,2μlwellsolution5.Sealthesecoverslipswithgreaseoverawell6.PlacetheVDXplatein16°

5、Cincubator.7.Observethecrystalsnextdayundermicroscope

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