基因组编辑技术

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1、基因组编辑应用基因编辑技术不长角的奶牛基因编辑的定义：通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。基因编辑的优势与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。基因编辑原理现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA双链断裂(DNAdouble-st

2、randbreaksDSBs)激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)两条途径。第一代:ZFN(锌指核酸酶)第二代:TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)第三代:CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)第四代：NgAgo-gDNA韩春雨基因编辑发展史ZFN基因组编辑技术ZFN技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys

3、2-His2锌指模块。1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。ZFN原理和机制ZFN由锌指蛋白(ZFP)和FokⅠ核

4、酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。ZFN诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。缺点:(1)以现有的策略设计高亲和性的

5、ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。TALEN基因组编辑技术2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN

6、更广阔的应用潜力。TALENs包含两个TALEN蛋白,每个TALEN都是由TALEarray与FokⅠ融合而成.其中一个TALEN靶向正义链上靶标位点,另一个则靶向反义链上的靶标位点.然后FokⅠ形成二聚体,在靶向序列中间的spacer处切割DNA,造成双链DNA断裂,随后细胞启动DNA损伤修复机制.针对不同的TALEN骨架,其最适宜的spacer长度不同,其长度范围一般为12~20bp.实验结果表明,TALENs在靶向DNA时,第一个碱基为T时其结合效果更佳。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列

7、进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。CRISPR/Cas9基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者首次在大肠杆菌(E.coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的序列。2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,C

8、RISPR)，现有测序结果显示40%的细菌基因组中含有CRISPR位点。2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/Cas是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转录生成crRNA前体(